Resolución C. 19-2010

Oficialízase el método "Determinación de natamicina en el vino por cromatografía líquida de ultra alta resolución masa/masa".

Mendoza, 31/5/2010

VISTO el Expediente Nº S93:0002892/2010, del Registro del INSTITUTO NACIONAL DE VITIVINICULTURA, y

CONSIDERANDO:

Que por el expediente mencionado en el Visto se tramita la oficialización del método de determinación de natamicina en vinos por cromatografía líquida de ultra alta resolución y detección masa - masa.

Que la adición de natamicina no constituye una práctica permitida en la REPUBLICA ARGENTINA, como tampoco en los países miembros de la UNION EUROPEA (UE) y en otros países vitivinícolas.

Que su uso tampoco es práctica recomendada por la ORGANIZACION INTERNACIONAL DE LA VIÑA Y EL VINO (OIV).

Que por ello, se hace necesario proceder a su control tanto en los vinos argentinos como en los importados.

Que dicha determinación posibilita el control de la aptitud para el consumo de los vinos en relación a este compuesto por Cromatografía Líquida de Ultra Alta Resolución.

Que el INSTITUTO NACIONAL DE VITIVINICULTURA (INV) ha incorporado recientemente tecnología analítica de última generación para optimizar tal cometido, mediante la adquisición de un Cromatógrafo Líquido de Ultra Alta Resolución Masa-Masa.

Que durante el año en curso, se iniciaron las gestiones ante la OIV a los fines de oficializar el método mediante el cual se establezca un límite de detección de la precitada sustancia, vinculado a posibles contaminaciones indirectas.

Que sobre el particular, la REPUBLICA FEDERAL DE ALEMANIA y el REINO UNIDO, han aceptado como criterio tecnológico un límite de CINCO MICROGRAMOS POR LITRO (5 µg.L^-1).

Que Subgerencia de Asuntos Jurídicos del INV ha tomado la intervención de su competencia. Por ello, y en uso de las facultades conferidas por las Leyes Nros. 14.878 y 24.566 y el Decreto Nº 1306/08,

EL PRESIDENTE DEL INSTITUTO NACIONAL DE VITIVINICULTURA

RESUELVE:

1º — Oficialízase el método "DETERMINACION DE NATAMICINA EN EL VINO POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ULTRA ALTA RESOLUCION MASA / MASA" que, junto a su VALIDACION, obra como ANEXO en la presente Resolución, en su versión en idioma español.

2º — A través de Subgerencia de Investigación para la Fiscalización dependiente de Gerencia de Fiscalización, continúense las gestiones iniciadas ante la ORGANIZACION INTERNACIONAL DE LA VIÑA Y EL VINO (OIV) para la adopción, por parte de dicha Organización, del método que por la presente se oficializa para vinos, el cual fija el límite de detección de CINCO MICROGRAMOS POR LITRO (5 µg.L^-1), en previsión de posibles contaminaciones indirectas.

3º — Regístrese, comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial para su publicación y cumplido, archívese. — Guillermo D. García.

ANEXO A LA RESOLUCION Nº C. 19 /10

DETERMINACION DE NATAMICINA EN VINOS POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ULTRA ALTA RESOLUCION MASA/MASA

1. AMBITO DE APLICACION:

Este método se utiliza para la identificación y cuantificación de Natamicina en vinos blancos, rosados y tintos.

2. PRINCIPIO:

El método determina la presencia de natamicina en vinos, mediante cromatografía líquida de Ultra Alta Resolución - MS/MS, basándose en la identificación de la masa del ión molecular 666,3 y de sus transiciones (hijos): 485,2 y 503,2.

3. REACTIVOS Y SUSTANCIAS:

3.1 Productos Químicos:

3.1.1 Natamicina Marca Sigma P9703-25 mg o equivalente.

3.1.2 Acetonitrilo f.d. HPLC, z.B. gradiente Fisher A 996-4 CAS 75-05-8 o equivalente.

3.1.3 Agua W 7-4 filtrada por 0,5 micrones CAS 7732-18-5 o equivalente.

3.1.4 Acido fórmico 98% - 100%, z.B. P.A. Merck Art. Nr.: 1.11670 o equivalente.

3.1.5 Metanol f.d. HPLC, z.B. pro análisis filtrado por 0,2 micrones Fisher A 454-4 CAS 7-56-1 o equivalente.

4. MATERIALES E INSTRUMENTAL:

4.1 Matraz aforado de 100 ml.

4.2 Matraz aforado de 50 ml.

4.3 Pipeta de doble aforo de 25 ml.

4.4 Pipeta de doble aforo de 10 ml.

4.5 Pipeta de doble aforo de 5 ml.

4.6 Pipeta de doble aforo de 1 ml.

4.7 Propipeta.

4.8 Sistema de Filtración al vacío Millipore o equivalente.

4.9 Filtro de Nylon de poro de 0,22 µm xe diám xro7 mm de marca µicroclar Y02047WPH o equivalente.

4.10 Membrana de nitrocelulosa blanca reticulada 0,45 µm x 47 mm Gamafil N04-047 o equivalente.

4.11 Probeta de 1000 ml graduada.

4.12 Frasco Genna de 1000 ml o equivalente.

4.13 Jeringa de volumen variable.

4.14 Filtro de jeringa para soluciones hidroalcohólicas de 0,45 µm Pall preferred (PVDF) 13 mm

PG-4457 o equivalente.

4.15 Balanza de precisión + 0,01 mg.

4.16 Vial UPLC de 1,8 ml 12x32 Gls Srw Cap VI w/Bnd pre-slt septa o equivalente.

4.17 Ultrasonido COLE - PALMER.

4.18 Columna: Acquity UPLC® BECH C18 1.7 µm 2.1 x 50 mm.

4.19 Precolumna.

4.20 Cromatógrafo UPLC-MS/MS equipado con ionización electro spray marca Waters.

5. PREPARACION DE SOLUCIONES:

5.1 Solución primaria de natamicina (100 mg.L^.-1)

Pesar 10 mg (4.15) de sustancia estándar (3.1.1), transferir a matraz de 100 ml y enrasar con metanol.

5.2 Solución secundaria de natamicina (5 mg.L^-1)

Tomar 5 ml de la solución primaria (5.1), transferir a matraz de 100 ml y enrasar con metanol.

5.3 Soluciones estándar de calibración en vino (5 µg.L^-1 10 µg.L^-1; 25 µg.L^-1 y 50 µg.L^-1). Utilizar vinos libre de natamicina.

Tabla Nº 1: Descripción de Diluciones

Filtrar las soluciones estándar de calibración en vino antes de la inyección a través de un filtro de jeringa (4.14).

5.4 Fase móvil:

5.4.1 Eluyente A: Agua, 0,1% de Acido Fórmico.

Medir aproximadamente 1000 ml de agua (3.1.3) en probeta graduada (4.11). Agregar 1 ml de ácido fórmico (3.1.4) y enrasar con agua (3.1.3). Homogeneizar y filtrar con membrana de nitrocelulosa (4.10) y sistema de filtración (4.8). Envasar en frasco Genna (4.12).

5.4.2 Eluyente B: Acetonitrilo + 0,1% de Acido Fórmico.

Medir aproximadamente 1000 ml de acetonitrilo (3.1.2) en probeta graduada (4.11). Agregar 1 ml de ácido fórmico (3.1.4) y enrasar con acetonitrilo (3.1.2). Homogeneizar y filtrar con filtro de nylon (4.9) y sistema de filtración (4.8). Envasar en frasco Genna (4.12).

6. PREPARACION DE LA MUESTRA:

Filtrar el vino a través de filtro de jeringa (4.14), recibir en un vial (4.16) y colocar en el inyector automático.

7. PROCEDIMIENTO:

Establecer los parámetros de trabajo:

Caudal: 0,3 ml/min.

Temperatura de la columna: 30 °C.

Temperatura de la muestra: 15 °C.

Volumen de inyección: 10 µl.

Loop de inyección: 10 µl.

Tiempo de retención: 4.3 minutos.

Tabla Nº 2: Gradiente de Elución

Tabla Nº 3: Parámetros de Detección

8. EXPRESION DE LOS RESULTADOS:

Los resultados se expresan en µg.L^-1 con una cifra significativa.

El ión de confirmación es la transición (ión hijo) 485,2.

El ión de cuantificación es la transición (ión hijo) 503,2.

9. PARAMETROS DE VALIDACION INTERNA:

Tabla Nº 4: Parámetros de validación

Tabla Nº 5: Rango dinámico de natamicina en vino blanco

Gráfico Nº 1: Rango Dinámico de Natamicina en Vino Blanco hasta 50 µg.L^-1.

Tabla Nº 6: Rango dinámico de natamicina en vino tinto

Gráfico Nº 2: Rango Dinámico de Natamicina en Vino Tinto hasta 50 µg.L^-1.

10. Cromatograma de vino con 25 µg.L^-1 de Natamicina.

Figura Nº 1: Ión molecular de natamicina.

Figura Nº 2: Iones de transición (hijos) de natamicina.

Nota 1: Tanto el equipamiento como las condiciones operativas se describen a modo de ejemplo.

Nota 2: En caso que la muestra contenga más de 50 µg.L^-1 se diluirá hasta que el valor ingrese dentro de la curva de calibración.

11. BIBLIOGRAFIA:

a) Perez, S; Barcelo, D "Application of advanced MS techniques to analysis and identification of human and microbial metabolites of pharmaceuticals in the aquatic environment". Review TRACTRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY. Pages 494 -514. 2007.

b) Jian Wang "Analysis of macrolide antibiotics, using liquid chromatographymass spectrometry, in food, biological and environmental matrices" Mass Spectrometry ReviewsVolume 28 Issue 1: 50 - 92. Published Online: 2008.

c) S. Abuin, R. Codony, R. Compañó "Analysis of macrolide antibiotics in river water by solidphase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry" Journal of Chromatography A. Volume 1114, Issue 1: 73-81. 2006.

d) Compendium of Internacional Methods of Wine and Must Análisis; Edición 2003. Anexo B; Resolución OENO 6/99.

e) Kennet Felrich, Detección instrumental de antibióticos en alimentos; Edición 1990: AOAC.