Resolución
351-2006
Actualízase
la reglamentación que permite el control de las vacunas destinadas a la
prevención de la Fiebre Aftosa.
Bs. As., 28/6/2006
VISTO el
Expediente Nº S01:0333752/2005 del Registro del MINISTERIO DE ECONOMIA Y
PRODUCCION, y
CONSIDERANDO:
Que resulta
necesario actualizar la reglamentación que permite el control de las vacunas
antiaftosa.
Que la vacunación
sistemática es un instrumento básico en la ejecución del Plan de Erradicación
de la Fiebre Aftosa.
Que se debe
actualizar la legislación de contralor atendiendo los avances científicos y
técnicos sucedidos.
Que se debe dar a
los productores pecuarios seguridad en cuanto al producto a aplicar.
Que la Dirección de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios y la Dirección de Laboratorios y Control Técnico están en condiciones de cumplir eficientemente
las distintas etapas de control que se establecen.
Que se han tenido
en cuenta las sugerencias del Consejo Asesor de Virología de este Servicio
Nacional y de las empresas involucradas en la elaboración y comercialización de
la vacuna antiaftosa.
Que para
introducir las modificaciones normativas que se pretenden promulgar se tuvieron
en cuenta las recomendaciones efectuadas por la ORGANIZACION MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) en la Quinta Edición del Manual de Test Diagnósticos y Vacunas para Animales Terrestres y el Código de Animales Terrestres, como
así también las conclusiones arribadas en el Seminario de Control de Vacuna
Antiaftosa - PANAFTOSA 2001 y el Grupo ad hoc de Producción y Control de
Vacunas Antiaftosa - PANAFTOSA 2005.
Que el Consejo de
Administración se pronunció favorablemente.
Que la Dirección de Asuntos Jurídicos emitió el correspondiente dictamen.
Que el suscripto
es competente para dictar la presente resolución en función de lo normado por
el inciso c), artículo 2º de la Ley de Aftosa Nº 24.305, y por los incisos c) y
l) del artículo 8º del Decreto Nº 1585 del 19 de diciembre de 1996, sustituido
por su similar Nº 680 del 1 de septiembre de 2003.
Por ello,
EL PRESIDENTE DEL
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA
RESUELVE:
Artículo 1º — La elaboración, importación, exportación, tenencia,
distribución y expendio de los productos destinados a combatir la Fiebre Aftosa será autorizada por el SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA a
través de sus Direcciones de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y
Veterinarios (DAPFyV) y de Laboratorios y Control Técnico (DILAB).
- DE LA CATEGORIZACION DE LOS ESTABLECIMIENTOS:
Art. 2º — A los efectos de la fabricación, importación,
exportación, tenencia, distribución y expendio de vacuna antiaftosa, de la
presente norma y de acuerdo a lo establecido en el Decreto Nº 583 del 31 de
enero de 1967 y en la Resolución Nº 345 del 6 de abril de 1994 del ex-SERVICIO
NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL, las personas físicas o jurídicas serán
categorizadas, según corresponda, de la siguiente manera:
a. Firmas
productoras de vacunas antiaftosa con establecimiento, registro, elaboración de
antígenos y formulación propios.
b. Firmas
productoras de vacunas que formulen con antígenos inactivados elaborados por
terceros y con registro propio.
c. Firmas que no
poseen establecimientos de elaboración y que acrediten fehacientemente, además
del derecho de comercialización, que el producto se elabora en establecimientos
habilitados, estando todo el proceso bajo la responsabilidad directa del
elaborador.
d. Firmas que
detenten Extensiones de Certificados de Productos elaborados por firmas
incluidas en el inciso a. del presente artículo.
Art. 3º — Las firmas incluidas en las categorías a., b., c. y
d. del artículo 2º de la presente resolución estarán sujetas a las exigencias
que se reglamentan en el presente artículo:
i. A la
habilitación del Establecimiento elaborador.
ii. Al Control de
las Normas de Bioseguridad.
iii. A los
controles de producción.
iv. A las pruebas
de registro o autorización del producto.
v. Al control de
series, previo a la venta y al uso de las vacunas.
vi. Al pago de
aranceles por las vacunas presentadas a control.
Art. 4º — Los titulares o responsables jurídicos de los
establecimientos de las categorías citadas en el artículo 2º de la presente
resolución, serán responsables de la pureza y legitimidad de los productos
elaborados, fraccionados, depositados y distribuidos.
Art. 5º — En las categorías c. y d. la totalidad de las
inspecciones que se establecen en la presente norma serán realizadas en las
instalaciones del laboratorio elaborador. El retiro de muestras de vacuna se
efectivizará en el lugar en donde hayan sido elaboradas. Al terminar los
controles oficiales de inocuidad del producto final y por pedido expreso del
elaborador, el SENASA podrá autorizar el traslado del total de la partida al
lugar en el que queden en caución hasta el final de los controles.
Art. 6º — La venta, cesión y traslado de antígenos inactivados
deberá ser expresamente autorizado por la DILAB con posterioridad a los controles de inocuidad oficiales.
Art. 7º — Establézcase que en los casos de Transferencia de
Certificados de Uso y Comercialización la firma a cuyo favor se concedió la
transferencia deberá realizar la correspondiente prueba de registro, excepto
que el producto se elabore en la misma planta y con iguales procedimientos. Si
esos controles no resultaran satisfactorios se cancelará el Certificado.
Art. 8º — Establézcase que en todos los casos la producción se
realizará en establecimientos habilitados por el SENASA.
DE LA HABILITACION Y DEL REGISTRO DE LOS LABORATORIOS:
Art. 9º — La inscripción y habilitación de los laboratorios
que elaboren antígenos y vacunas destinados a prevenir la Fiebre Aftosa será gestionada ante el SENASA, llenando con carácter de Declaración Jurada,
una solicitud que, además de adecuarse a los alcances de las Resoluciones Nros.
345 del 6 de abril de 1994 y 765 del 3 de diciembre de 1996, ambas del
ex–SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANINAL, haga constar:
1. Nombre de la
firma comercial.
2. Nombre del
Director y/o Responsable Técnico con Título de Profesional de las Ciencias
Veterinarias, expedido, reconocido, habilitado o revalidado por Universidad
Nacional.
3. Organigrama
donde consten los profesionales responsables de Producción, Control de
Producción, Aseguramiento de Calidad, Bioseguridad y Mantenimiento.
4. Ubicación del
laboratorio, con habilitación municipal.
5. Planos de los
locales, memoria descriptiva de las instalaciones y equipos destinados a la
bioseguridad, producción, cuarentena, control, envase, conservación, expendio y
demás controles de conformidad con el tipo de producto elaborado.
6. Capacidad de
elaboración mensual de los productos terminados.
7. Si posee campo
experimental deberá presentar ubicación y planos de las instalaciones.
8. Normas y
procedimientos de Bioseguridad implementadas en todos los espacios donde se
manipule el virus aftoso que garanticen su no diseminación.
Los puntos 5 y 6
del presente artículo deberán ajustarse a los requisitos exigidos en el Anexo I
de la presente resolución. Las Condiciones y Normas de Bioseguridad tendrán que
ajustarse a los requisitos establecidos en el Anexo II de la presente norma.
En ningún caso se
permitirá el manejo de virus activo ni la aplicación de vacunas antiaftosa sin
los correspondientes controles de inocuidad y autorización previa por parte de la DILAB.
Art. 10. — La habilitación de los laboratorios y las
autorizaciones de elaboración, importación, exportación y venta de vacunas
antiaftosa que se otorguen al amparo de la presente resolución, podrán ser
revocadas o suspendidas sin derecho a indemnización alguna, si se demuestra con
hechos fundados y protocolizados el incumplimiento de las disposiciones
contenidas en la presente norma.
Art. 11. — Efectuadas las inspecciones y verificado el
cumplimiento de los requisitos establecidos el SENASA concederá la
habilitación, expidiendo oportunamente el Certificado de Habilitación
respectivo y procediendo a registrar al laboratorio en el Registro Nacional
correspondiente, previo informe favorable de la DAPFyV y la DILAB.
DE LA SEGURIDAD BIOLOGICA
Art. 12. — La manipulación del virus aftoso se podrá realizar
únicamente en los laboratorios expresamente habilitados por la DILAB:
La Comisión de Bioseguridad del SENASA establecerá y controlará
las condiciones de Seguridad Biológica que deberán poseer los laboratorios de
diagnóstico, producción, control e investigación y los locales para inocular
animales que manipulan virus infeccioso de Fiebre Aftosa, que se enmarcarán en
el nivel de Bioseguridad 3 Agricultura (NBS 3 A) Anexo II.
Art. 13. — Requisitos obligatorios con los que deberán contar
las plantas elaboradoras de antígenos y vacunas:
a) Locales
aislados para la producción del virus aftoso con presión de aire negativa
diferencial y sistemas de esclusa para introducción y salida de personal,
materiales y residuos, que garanticen su decontaminación.
b) Un control y
registro de acceso y salida de las personas de los locales mencionados; éstas
deberán ducharse y cambiar totalmente su ropa previo a su retiro.
c) Sistemas de
tratamiento de los efluentes líquidos y sólidos del área de manipulación de
virus infeccioso. Como consecuencia de la manipulación de virus aftoso, los
desechos generados deberán ser tratados, previo a su eliminación, con
sustancias o métodos que aseguren la destrucción total del virus.
d) Sistemas para
filtrar el aire de manera que se garantice que no salga virus infeccioso al
exterior.
e) Sistemas de
emergencia de suministro de corriente eléctrica.
f) Supervisor de
Seguridad Biológica.
g) El personal
deberá estar entrenado para cumplir con las normas de bioseguridad.
DE LAS NORMAS
GENERALES:
Art. 14. — Las firmas debidamente inscriptas según lo
establecido en los artículos precedentes deberán presentar para la aprobación
de los productos destinados a la Prevención de la Fiebre Aftosa, una Solicitud de Registro de Productos Biológicos, que además de adecuarse a
la normativa vigente (Resoluciones ex–SENASA Nros. 345/94 y 765/96) para el
Registro y la Aprobación de Productos destinados al Diagnóstico, Prevención o
Tratamiento de las enfermedades de los animales, incluya la totalidad de las
respuestas que respondan a las preguntas que efectúen los funcionarios de la DILAB para asegurar que el producto cumplirá con lo requerido en esta norma.
Art. 15. — Autorízase la inscripción en el Registro Nacional De
Productos Veterinarios, de las vacunas con adyuvante oleoso o cualquier otro
adyuvante que en el futuro pudiera surgir y que cuente con los suficientes
antecedentes científicos y/o pruebas experimentales propias, como para
garantizar una duración de inmunidad de SEIS (6) meses o más en animales
primovacunados y de UN (1) año o más en animales revacunados.
Art. 16. — Serán autorizadas únicamente vacunas inactivadas con
inactivantes químicos de primer orden. Deberá efectuarse un procedimiento
validado de doble inactivación, con cambio de tanque del antígeno durante el
proceso de inactivación.
Art. 17. — Los tipos y subtipos de virus aftoso a ser
utilizados para la producción y el control de las vacunas de uso en el
Territorio Nacional serán establecidos por el SENASA y entregados por
intermedio de la DILAB. Se informará con la debida antelación cualquier cambio
en las cepas de producción y control. El SENASA autorizará expresamente en cada
caso la producción de antígenos y vacunas con cepas no utilizadas en el
Territorio Nacional con fines de exportación o como componentes de bancos de
antígenos y vacunas.
Art. 18. — El volumen de la dosis para bovinos de toda vacuna
con adyuvante oleoso no podrá ser menor a DOS (2) mililitros ni mayor a CINCO
(5) mililitros.
Art. 19. — Cuando la situación epidemiológica lo requiera y
ante la solicitud de la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), la DILAB podrá disponer el control de vacunas inactivadas monovalentes, que será ejecutado de
conformidad con las pautas reglamentadas en la presente resolución para las
vacunas polivalentes.
Art. 20. — Podrán ser liberadas vacunas para emergencia con
controles oficiales de inocuidad de fase acuosa o vacuna final, controles
internos del elaborador como Declaración Jurada y controles de producción cuando
la situación epidemiológica así lo requiera y la DNSA lo solicite con motivos debidamente fundamentados.
Art. 21. — La DILAB tendrá acceso a todas las etapas del
proceso de elaboración de las vacunas antiaftosa y efectuará inspecciones
periódicas con el fin de controlar la producción, el buen estado de los
locales, de las instalaciones y de los equipos de los laboratorios habilitados,
así como el cumplimiento de las normas de bioseguridad establecidas, de acuerdo
a un cronograma elaborado y con una periodicidad no menor a DOS (2) veces por
año.
Art. 22. — Se autoriza al personal de la DILAB para retirar muestras de los distintos componentes que integran la vacuna en las etapas
de elaboración, a fin de someterlos a los controles correspondientes y al
retiro de muestras del producto semielaborado y terminado.
Art. 23. — No podrá presentarse a control ni expenderse ningún
envase de vacuna antiaftosa sin su correspondiente estampilla oficial numerada
provista por el SENASA o por un proveedor oficializado, que certifique la serie
que corresponda, su fecha de vencimiento y la cantidad de dosis que contiene.
En cada serie de
vacuna para uso local se presentarán, como mínimo, DOS (2) tamaños de envase
debiendo el menor tamaño representar al menos el VEINTE POR CIENTO (20 %) del
total. El envase de mayor tamaño contendrá como máximo CIENTO VEINTICINCO (125)
dosis de DOS (2) mililitros y el envase de menor tamaño será de CINCUENTA (50)
dosis de DOS (2) mililitros como máximo.
Art. 24. — La DILAB autorizará la venta y uso de vacuna
antiaftosa después de verificar:
a) Tipo y subtipo
del virus vacunal.
b) Inocuidad.
c) Masa
antigénica.
d) La ausencia de
gérmenes viables.
e) Controles
físico-químicos.
f) Eficacia.
g) Tolerancia.
h) Pureza (no
inducción de anticuerpos contra proteínas no estructurales).
Queda facultada la DILAB para realizar cualquier otro control adicional que considere necesario a fin de
asegurar la correcta elaboración según lo declarado en el expediente de
registro, condiciones de bioseguridad y conservación de las vacunas, así como
el correcto desempeño del producto una vez aplicado.
Art. 25. — Fíjase el plazo de vencimiento de las vacunas en
VEINTICUATRO (24) meses, contados a partir de la fecha de inactivación del
primer componente monovalente integrante de cada serie, siempre que las
condiciones de conservación sean las establecidas y se hayan aprobado los
controles requeridos en la presente resolución.
DE LOS PRODUCTOS A
IMPORTAR:
Art. 26. — Sólo se autorizará la importación de antígenos o
vacunas en cuyo proceso de producción se utilicen materias primas de origen
bovino y materias primas de origen bovino importadas para producción local, que
resulten autorizadas por la Resolución Nº 117 del 22 de enero de 2002 y su
similar modificatoria Nº 1.052 del 30 de diciembre de 2002, ambas del SERVICIO
NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, que establecen la evaluación de
la situación de riesgo de Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) para cada
país exportador.
Art. 27. — Las firmas interesadas en la importación de vacunas
antiaftosa o antígenos inactivados deberán cumplir la totalidad de las
exigencias y condiciones que se establecen en la presente resolución, y deberán
poseer locales e instalaciones habilitadas para la formulación, conservación y
expendio, según el caso, de estos productos, acorde a lo establecido en la
presente reglamentación.
La aprobación
pertinente se deberá gestionar ante el SENASA, la cual se concederá, si
correspondiere, previa inspección y habilitación del establecimiento elaborador
por la DILAB.
Previo al inicio
de los trámites de registro los interesados deberán presentar la habilitación
del Ente Sanitario Oficial del país de origen para la elaboración de vacuna
antiaftosa y autorización para que el laboratorio elaborador pueda trabajar con
las cepas de virus aftoso establecidas por el SENASA.
Art. 28. — Las vacunas o antígenos inactivados importados serán
sometidos a la totalidad de los controles establecidos en la presente
reglamentación, al igual que los aplicados a las vacunas elaboradas en el país.
DE LA EXPORTACION DE VACUNAS:
Art. 29. — Las exportaciones de vacunas antiaftosa o de
antígenos inactivados deberán ser autorizadas por el SENASA, previo informe
favorable de la DILAB. Las autorizaciones de exportación se extenderán a
laboratorios habilitados con registro aprobado de uso local o con extensión de
certificado. A ese efecto, las firmas interesadas deberán formular por escrito
las peticiones respectivas, fundamentadas, ante la DILAB. El SENASA efectuará, previo a la exportación, los controles de inocuidad y aquéllos
que sean requeridos por el país importador.
Se autorizarán las
exportaciones siempre que estén aseguradas las necesidades de abastecimiento
del país.
DE LA ADMISION Y DEL REGISTRO DE LAS VACUNAS:
Art. 30. — Los productos cuyo Certificados de Uso y
Comercialización se soliciten serán sometidos por la DILAB a los controles que determina esta reglamentación bajo la denominación de:
a) Control de
autorización o registro.
b) Control de
series.
Art. 31. — Las firmas con laboratorios habilitados en el
Registro Nacional de Productos Veterinarios, que a tal efecto lleva la DAPFyV, deberán gestionar ante dicha dependencia la solicitud de inscripción de las vacunas
destinadas a prevenir la Fiebre Aftosa que deseen elaborar, adecuando el
contenido de las presentaciones a lo establecido en la normativa en vigencia
(Resoluciones Nros. 345/94, 765/96, ambas del ex-SENASA, y 897/02 del SENASA)
además de incluir, capacidad de inducción de anticuerpos contra proteínas no
estructurales, y toda otra información que el SENASA considere necesaria.
Previo a la
presentación de la primera serie de registro a control, las firmas presentarán
resultados de pruebas experimentales propias en la especie de destino que demuestre
la respuesta del producto, como así también antecedentes científicos y
bibliográficos.
El laboratorio
productor deberá presentar antecedentes que demuestren que el sistema de
producción utilizado asegura la ausencia de inducción de reactores a pruebas de
detección de anticuerpos contra proteínas no estructurales utilizadas
oficialmente en la vigilancia epidemiológica de la Fiebre Aftosa. Como mínimo se deberán presentar datos de ensayos en primovacunados a los
TREINTA (30) o SESENTA (60) días post vacunación y datos con una revacunación a
los TREINTA (30) o SESENTA (60) días post vacunación y evaluados a los TREINTA
(30) días post revacunación (DPR). Las pruebas deberán efectuarse con un mínimo
de DIECISEIS (16) bovinos.
Se deberán
acompañar los proyectos de rótulos y folletos a utilizar de acuerdo a la
normativa vigente mencionada anteriormente.
DE LAS PRUEBAS DE
AUTORIZACION O REGISTRO:
Art. 32. — Se considerarán pruebas de registro de vacuna
antiaftosa aquellas a las que se somete a dichos inmunógenos con el fin de que
las personas físicas o jurídicas recurrentes puedan obtener el Certificado de
Uso y Comercialización pertinente.
Art. 33. — A fin de la aprobación de la serie de registro los
laboratorios habilitados deberán:
a) Comunicar por
escrito a la DILAB con una anticipación no menor a CINCO (5) días hábiles, el
cronograma de producción, la formulación y el envase.
b) Presentar ante la DILAB el sistema de protocolización adoptado para registrar los procesos de producción y los
controles internos que permitan una eficaz auditoría.
c) Registrar la
información relativa a la constitución, al proceso de elaboración y control,
debiendo consignar como mínimo lo siguiente: número del protocolo, tipo de la
vacuna, número de la serie, cantidad de dosis, fechas de elaboración, y
características y controles de:
- SEMILLAS
VIRALES: Control de calidad de semillas, certificación de origen, pureza,
control de contaminantes adventicios; perfil de anticuerpos monoclonales y
secuencia.
- ANTIGENOS: Tipo
y subtipo de virus, título viral, masa antigénica; número de los protocolos de
los cultivos que la integran; fecha de elaboración, cantidad expresada en
unidades de peso y volumen.
- INACTIVACION:
composición química, concentración y preparación del inactivante, temperatura y
tiempo, cinética de inactivación, control de inocuidad.
- OTROS
COMPONENTES: Controles de calidad de las materias primas.
Control de
calidad, certificación de origen, control de micoplasmas y otros adventicios en
banco de cultivos celulares.
Control de
calidad, certificación de origen y control de contaminantes adventicios en
suero y otros componentes de origen animal.
Control de Calidad
de adyuvantes, emulsionantes, conservadores.
Protocolos de
formulación y envase.
Controles de
inocuidad, de esterilidad, físico-químicos y seguridad con indicación del
procedimiento utilizado y las etapas en que fueron efectuados.
Los registros de
los procesos de elaboración y de los controles internos presentados por el
laboratorio elaborador deberán ser rubricados por el Responsable de Producción
y de Aseguramiento de Calidad, tendrán carácter de Declaración Jurada y deberán
seguir normas de aseguramiento de la calidad y buenas prácticas de manufactura
de conformidad con lo establecido en la Resolución Nº 482 del 24 de mayo de 2002 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA.
Art. 34. — La totalidad de los controles internos por parte del
elaborador deberán estar finalizados al momento del retiro de las muestras del
producto final debidamente envasado, rotulado y estampillado según se establece
en la presente.
Art. 35. — El laboratorio productor deberá comunicar por
escrito, con una anticipación no menor a CINCO (5) días hábiles, el detalle del
fraccionamiento y envasado de la serie a ser presentada a control, indicando el
número de la serie y la fecha de su vencimiento.
El laboratorio
productor deberá presentar los protocolos definitivos de fabricación y control
conjuntamente con el pedido de retiro de muestras de la vacuna totalmente
elaborada, envasada y debidamente estampillada.
Art. 36. — La DILAB autorizará las vacunas antiaftosa que den
cumplimiento a las siguientes especificaciones y controles:
a) Virus Aftoso:
Los tipos y subtipos de virus aftoso a utilizar en la producción y el control
de vacunas antiaftosa serán 0 1 Campos, A 24 Cruzeiro, A Argentina 2001 y C 3
Indaial, que serán entregados por la DILAB.
Los métodos de
manufactura autorizados son el cultivo celular de la línea BHK 21 clon 13 o
epitelio lingual bovino en supervivencia.
b) Controles de
Producción: La DILAB verificará durante el proceso de producción de cada serie:
• Tipo, subtipo.
• Título viral.
• Pureza.
• Masa antigénica.
• Cinética de
inactivación.
• Inocuidad: se
determinará la ausencia de virus activo en muestras de: tanques de producción,
fase acuosa y producto final (Anexo V de la presente resolución). El elaborador
deberá indicar el procedimiento de ruptura de emulsión más adecuado para su
vacuna.
• Controles
bacteriológicos: deberá estar libre de bacterias y hongos viables de acuerdo
con las técnicas establecidas por el laboratorio productor.
• Físico-químicos
y cualquier otro que se considere necesario.
c) Controles sobre
el producto final: la DILAB realizará:
I. Inocuidad: de
acuerdo al Anexo V de la presente resolución.
II. Controles
bacteriológicos: Deberá estar libre de bacterias y hongos viables, de acuerdo
con las técnicas establecidas por la DILAB (Anexo IV de la presente
resolución).
III. Controles
físico-químicos: las características físico-químicas de las vacunas serán las
enunciadas por el laboratorio productor. Las determinaciones físico-químicas se
efectuarán de acuerdo con las técnicas establecidas por la DILAB (Anexo IV de la presente resolución) o, en su defecto, las enunciadas por el productor.
IV. Potencia: La
prueba de potencia o eficacia para los controles de autorización se efectuará
en DIECISEIS (16) bovinos por el método de la Protección a la Generalización Podal (PGP) a los NOVENTA (90) días post vacunación (Anexo
VIII de la presente resolución). La prueba de PGP se efectuará en las cepas 01
Campos y A Argentina 2001.
V. Las cepas A24
Cruzeiro y C3 Indaial se aprobarán según el nivel de anticuerpos por ELISA –
fase líquida, acorde al artículo 46 de la presente norma.
VI. Control de
tolerancia: La vacuna no debe provocar reacciones locales o generales
indeseables en los animales vacunados, utilizándola según el laboratorio
productor. Las pruebas de control de tolerancia se realizarán según lo
establecido por la DILAB (Anexo IX de la presente resolución) la prueba de
tolerancia podrá extenderse a la inspección a campo y a las especies para las
cuales sea recomendado su uso en el momento en que la DILAB lo estime conveniente.
VII. Prueba de
estabilidad inmunogénica: La DILAB podrá optar por su realización previa
comunicación al laboratorio productor. Se procederá de acuerdo al método
establecido para el control de eficacia de series y podrá ser realizada hasta
la fecha de vencimiento de la vacuna.
VIII. Control de
interferencia con técnicas de detección de anticuerpos contra proteínas no
estructurales del virus de la Fiebre Aftosa en bovinos. Sobre los sueros de
SESENTA (60) días post vacunación de los animales utilizados en la prueba de
potencia, se efectuarán pruebas de detección de anticuerpos contra proteínas no
estructurales iguales a las utilizadas en los monitoreos serológicos efectuados
por la DNSA: ELISA 3 ABC / EITB (Anexo XI de la presente norma).
Art. 37. — Con el método establecido en el artículo 36, inciso
c), numeral IV. la dosis de vacuna deberá proteger al menos al SETENTA Y CINCO
POR CIENTO (75 %) de los animales vacunados. Si la vacuna no alcanzara el nivel
exigido en una sola y única valencia pero protegiera en esa valencia entre el
SESENTA Y DOS (62 %) y el SETENTA Y CUATRO POR CIENTO (74 %) de los animales
vacunados, el laboratorio productor podrá, por única vez, solicitar la
repetición del control de potencia en esa valencia, utilizándose la misma
cantidad de animales. Se dará por aprobada la vacuna que en el recontrol
protegiera como mínimo al SETENTA Y CINCO (75 %) por ciento de los animales
vacunados. Si la vacuna protegiera menos del SESENTA Y DOS POR CIENTO (62 %) de
los animales vacunados en una o más de las valencias, será desaprobada. La
prueba será válida si todos los parámetros de control son considerados normales
por la DILAB.
Art. 38. — En caso de muerte (por causas no atribuibles al acto
de la vacunación) de hasta el TREINTA Y CINCO (35 %) de los bovinos vacunados,
la prueba se considerará válida dándose como aprobada toda serie que proteja
como mínimo el SETENTA Y CINCO (75 %) de los animales que puedan ser
controlados. Si protegiera entre el SESENTA Y DOS (62 %) y el SETENTA Y CUATRO
POR CIENTO (74%) el laboratorio productor podrá solicitar por única vez el
recontrol en esa valencia. Toda serie que protegiera menos del SESENTA Y DOS
POR CIENTO (62 %) será rechazada.
La DILAB dispondrá sobre cualquier otra situación derivada de
la muerte de animales durante el desarrollo de la prueba.
Art. 39. — Los sueros de los bovinos de la prueba de potencia
se analizarán a los CERO (0) y SESENTA (60) días post vacunación (DPV) con la
técnica establecida en el artículo 36, inciso c), numeral VIII.
La vacuna será
aprobada cuando haya ausencia de reactores a ELISA 3ABC/ EITB.
De presentarse
bovinos reactores a los CERO (0) DPV no serán considerados para la prueba de
los SESENTA (60) DPV.
De presentarse
hasta DOS (2) animales reactores a los SESENTA (60) DPV se realizará un
recontrol sobre un nuevo grupo de DIECISEIS (16) bovinos vírgenes.
Si a los SESENTA
(60) DPV en el grupo de recontrol no hay reactores, la vacuna será aprobada en
ese control.
Si en el grupo de
bovinos en recontrol se detectan hasta DOS (2) reactores, ese grupo deberá ser
revacunado con UNA (1) dosis, y la vacuna será aprobada si no hay nuevos
reactores a los TREINTA (30) DPR, caso contrario la vacuna será rechazada y
decomisada.
Art. 40. — Las series de vacunas que no aprobaran los controles
de identidad, físico-químicos, inocuidad, bacteriológicos y anticuerpos contra
proteínas no estructurales no podrán continuar con las siguientes etapas de
control y se procederá a su decomiso.
Art. 41. — En las vacunas antiaftosa para bovinos, porcinos,
ovinos y caprinos, el control de autorización se efectuará en bovinos. Para el
caso de una vacuna destinada exclusivamente a otra especie, el control podrá
ser efectuado en animales de dicha especie. La DILAB podrá disponer, cuando lo considere necesario, el control de eficacia y de interferencia con técnicas de
detección de proteínas no estructurales en las otras especies cuando se
disponga de métodos validados.
Art. 42. — Las series presentadas a los controles de
autorización no podrán ser inferiores a TRESCIENTAS CINCUENTA MIL (350.000)
dosis de vacuna polivalente.
Cada serie deberá
ser homogénea; por ello, el laboratorio elaborador deberá poseer un tanque con
capacidad suficiente para formularla.
Art. 43. — Finalizada la totalidad de los controles de
autorización con resultados satisfactorios se otorgará el Certificado de Uso y
Comercialización. Las series rechazadas o retiradas de control serán
decomisadas en un plazo máximo de SESENTA (60) días.
Las series
presentadas quedarán en cuarentena hasta la finalización de los controles
oficiales y no podrán ser modificadas o reprocesadas.
Art. 44. — Una vez obtenido el Certificado de Uso y
Comercialización todas las series elaboradas con posterioridad deberán ser
sometidas a los controles de serie según lo descripto en la presente
reglamentación.
DEL CONTROL DE
SERIES:
Art. 45. — Las personas físicas o jurídicas deberán tener
presentado el Control de Autorización previo a la presentación de cada una de
las series de uso local y su aprobación será ad referéndum de la serie de
registro.
En todas las
series se deberá dar cumplimiento a lo establecido en los artículos 33, 34, 35,
39, 40, 41, 42 y 43 de la presente resolución.
Cada serie
presentada a control será sometida a los controles establecidos en el artículo
36, incisos a), b) y c), numerales I, II, III, VI, VIII de la presente
resolución.
La fórmula
cuali-cuantitativa y el proceso de producción de las series deberán ser iguales
a la serie de registro aprobada.
Art. 46. — El control de eficacia de cada una de las series se
realizará por los métodos indirectos establecidos en la presente resolución
(Anexo X). El análisis se realizará sobre el suero de DIECISEIS (16) de los
bovinos vacunados. Los sueros se analizarán por las técnicas establecidas por la DILAB: ELISA en fase líquida o cualquier otra que en un futuro demuestre similar
comportamiento. Se establece como metodología estándar de trabajo los
protocolos que figuran en el Anexo X de la presente resolución. La DILAB queda facultada a su modificación toda vez que los avances técnicos y metodológicos así
lo aconsejen, con previo aviso a las personas físicas o jurídicas interesadas.
Estas modificaciones tendrán vigencia para las series presentadas con
posterioridad a los SESENTA (60) días de su reglamentación.
Art. 47. — Serán aprobadas en eficacia las series de vacunas
que por la técnica de ELISA en fase líquida a título final obtengan, a los
SESENTA (60) DPV mas menos CINCO (5) días, un valor igual o mayor de promedio
de título de UNO COMA NOVENTA (1,90) para O1 Campos, UNO COMA NOVENTA Y CINCO
(1,95) para A24 Cruzeiro, DOS COMA VEINTE (2,20) para A Argentina 2001 y UNO
COMA NOVENTA Y CINCO (1,95) para C3 Indaial. Si la serie de vacuna obtuviera un
promedio de título menor a UNO COMA SESENTA (1,60) para O1 Campos, UNO COMA
SESENTA Y CINCO (1,65) para A24 Cruzeiro, UNO COMA NOVENTA (1,90) para A 2001 y
UNO COMA SESENTA Y CINCO (1,65) para C3 Indaial, será rechazada y decomisada.
Si la serie de vacuna en control obtuviera entre UNO COMA SESENTA (1,60) y UNO
COMA OCHENTA Y NUEVE (1,89) para O1 Campos, UNO COMA SESENTA Y CINCO (1,65) y
UNO COMA NOVENTA Y CUATRO (1,94) para A24 Cruzeiro, UNO COMA NOVENTA (1,90) y
DOS COMA VEINTINUEVE (2,29) para A Argentina 2001 y UNO COMA SESENTA Y CINCO
(1,65) y UNO COMA NOVENTA Y CUATRO (1,94) para C3 Indaial, el laboratorio
productor podrá, por única vez, solicitar el recontrol de la serie.
Para el recontrol
se utilizará un nuevo grupo de DIECISEIS (16) animales. Se dará por aprobada la
vacuna que en el recontrol realizado a los SESENTA (60) DPV obtuviera un
promedio de título de NOVENTA PUNTO UNO (1.90) para O1 Campos, UNO COMA NOVENTA
Y CINCO (1,95) para A24 Cruzeiro, DOS COMA VEINTE (2,20) para A Argentina 2001
y UNO COMA NOVENTA Y CINCO (1,95) para C3 Indaial.
Art. 48. — Una vez aprobados los controles de autorización, y
de acuerdo con la disponibilidad de boxes de desafío las primeras DOS (2)
series del nuevo producto serán sometidas a los controles de eficacia por el
método de Protección a la Generalización Podal (PGP), en las valencias A24 Cruzeiro y C3 Indaial.
Art. 49. — El control de pureza se realizará de acuerdo a lo
establecido en el artículo 39 de la presente resolución.
Art. 50. — La DILAB podrá disponer, dentro de cada prueba, la
realización de la descarga en bovinos (PGP) en una o varias de las series de
vacunas controladas por pruebas indirectas.
Art. 51. — En los casos contemplados en los artículos 48 y 50
de la presente resolución los valores de aprobación, recontrol y rechazo serán
los establecidos en el artículo 37 de la presente resolución.
Art. 52. — Finalizados la totalidad de los controles, con
resultados satisfactorios, la DILAB otorgará el correspondiente Certificado de
Uso y Comercialización de la serie en control.
DE LAS
DISPOSICIONES GENERALES:
Art. 53. — Los controles de autorización y los de series serán
analizados por personal del servicio oficial en las dependencias de la DILAB o en aquéllas que el SENASA determine.
Art. 54. — Cuando una serie de vacuna antiaftosa no aprobara
los controles oficiales corresponderá su inutilización, quedando obligado el
laboratorio productor a entregar la totalidad de la partida en donde la DILAB disponga, para su verificación y total destrucción, dentro de los SESENTA (60) días de
la notificación oficial del rechazo; las series de vacunas retiradas de control
por cualquier motivo que comunique el laboratorio elaborador serán consideradas
como rechazadas.
Art. 55. — Las series de vacunas presentadas a control de
autorización o serie quedarán interdictas en el lugar establecido y autorizado
por la DILAB, desde la extracción de la muestra hasta que la DILAB lo determine. A solicitud del elaborador la DILAB podrá autorizar el traslado de las
series en control, una vez aprobado el control de inocuidad, a una cámara
autorizada.
Las firmas
elaboradoras asegurarán bajo Declaración Jurada y con utilización de precintos
o cerramientos que garanticen la inviolabilidad del producto, la permanencia de
la totalidad de las dosis presentadas a control en las cámaras autorizadas
durante todo el proceso.
Art. 56. — La temperatura de conservación de la vacuna
antiaftosa estará comprendida entre los CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C) y OCHO
GRADOS CENTIGRADOS (8° C). Se permitirá durante el transporte un máximo de
QUINCE GRADOS CENTIGRADOS (15° C) por no más de SETENTA Y DOS (72) horas. No
debiendo ser congelada.
Art. 57. — El laboratorio arbitrará las medidas necesarias para
que los productos sean remitidos y conservados hasta que lleguen a poder del
destinatario en las condiciones especificadas en la solicitud de inscripción.
Serán incorporados sensores de frío que verifiquen la temperatura de
conservación de las vacunas desde la salida del producto en las cámaras
habilitadas por el SENASA a tal efecto, hasta los lugares de almacenamiento de
los entes encargados de su aplicación (Anexo XII de la presente resolución).
Art. 58. — Las infracciones que se comprueben serán sancionados
de acuerdo a lo previsto en las Leyes Nros. 23.899 y 24.305; podrá disponerse
con carácter de penalidad accesoria la cancelación de la autorización, del
permiso o de la habilitación del establecimiento infractor y su clausura.
Art. 59. — Las personas físicas o jurídicas que sean titulares
de Certificados de Uso y Comercialización de vacunas antiaftosa deberán adoptar
las medidas necesarias para que los frascos que las contengan, luego del
proceso de producción y envase respectivo, presenten en su boca precinto o
tapas que aseguren la inviolabilidad del producto, evitando también el posible
rellenado. Cada firma o persona física-jurídica recurrente tendrá asignado un
color, convalidado por la DILAB.
Art. 60. — Declárense públicas las pruebas oficiales de control
de vacunas antiaftosa en todas sus etapas.
Art. 61. — Cambio del tipo de método de manufactura, método de
concentración, inactivante, adyuvantes y volumen de dosis implicara la
realización de un nuevo registro de autorización.
Art. 62. — La DILAB será el órgano rector para la
interpretación y decisión en aquellas cuestiones no contempladas en la presente
norma.
Art. 63. — Déjase sin efecto la Resolución Nº 219 del 7 de abril de 1995 del ex–SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL.
Art. 64. — Comuníquese, publíquese y dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y archívese. — Jorge N. Amaya.
ANEXO I
HABILITACION DE
LABORATORIOS, CARACTERISTICAS EDILICIAS,
EQUIPAMIENTO Y
CAPACIDAD OPERATIVA
De acuerdo con lo
dispuesto por la presente resolución y sin perjuicio de lo establecido en el
Decreto Nº 583/67, y en las Resoluciones ex-SENASA Nros. 345/94 y SENASA
482/2002, los laboratorios que se dediquen a la elaboración de vacunas
antiaftosa comprendidos en la Categoría "a" del artículo 2º de la
presente resolución, deberán cumplir con las siguientes exigencias para su
habilitación:
1. Contar con DOS
(2) zonas debidamente separadas: la zona contaminada, que será independiente de
los lugares en que se elaboren otros tipos de productos, y la zona limpia que
podrá ser común a otros productos.
2. En ambas zonas,
las paredes, los pisos, las mesadas y los techos serán lisos, sin juntas, de
materiales lavables y que permitan el uso de desinfectantes, ácidos y álcalis y
el calor moderado. Los zócalos y las uniones entre paredes deberán ser
redondeados. No deberá existir diferencia de nivel entre las superficies de
ventanas y paredes.
3. La zona
contaminada comprenderá ambientes destinados a la replicación del virus aftoso
para semilla, la producción de antígenos en reactores, su inactivación y
cuarentena y áreas destinadas a los controles de producción.
4. Los productos
en control de inocuidad deberán mantenerse en cuarentena hasta la finalización
del control asegurándose la no contaminación.
5. La liberación
de antígenos inactivados a la zona limpia deberá estar documentada y realizada
bajo un procedimiento aprobado por el responsable de bioseguridad.
6. El área de
control deberá contar con el equipamiento necesario para pruebas de ELISA o
fijación de complemento, masa antigénica, titulación viral, inocuidad y
esterilidad.
7. Toda la zona
contaminada deberá estar separada del exterior y de la zona limpia por paredes
de mampostería revestidas con pintura epoxi o revestimiento vinílico y
elementos de seguridad que cumplimenten lo exigido en el Anexo II de la
presente resolución.
8. El paso de
cañerías de los distintos servicios, entre las zonas limpia y contaminada,
deberá minimizarse, deberá estar sellado herméticamente y con dispositivos anti
retorno.
9. Deben
independizarse los sistemas y los servicios de las áreas limpia y contaminada,
asegurando la hermeticidad del área contaminada.
10. La producción
deberá realizarse en sistemas cerrados, evitando la formación de aerosoles y
derrames.
11. La
manipulación de virus y muestras potencialmente infecciosas fuera de vasos
cerrados deberá realizarse en cabinas de seguridad biológica clase II,
certificadas anualmente por una empresa externa.
12. En la zona
contaminada los ambientes destinados a las distintas tareas estarán
distribuidos y separados de tal forma que se aseguren las condiciones adecuadas
para el aislamiento requerido en la elaboración, la cuarentena y los controles
de calidad. Las puertas serán de cierre automático y con cierre adecuado para
permitir que se mantengan los diferenciales de presión entre ambientes.
13. Dentro del
área contaminada podrá incluirse un área para animales de laboratorio, que
deberá contar con un vestuario con ducha suplementario, diferencial de presión
y procedimientos para la inoculación de animales y tratamiento de residuos.
14. La zona limpia
estará formada por los ambientes destinados a producción de cultivos celulares,
medios de cultivos, la formulación y emulsificación de las vacunas, los
controles de las vacunas inactivadas, depósito de suero y materias primas, como
así también las salas destinadas a envase y etiquetado de las vacunas
terminadas.
15. La sala de
envase deberá contar con vestuario de ingreso, área de envasado bajo flujo
laminar, presión positiva e inyección de aire a través de filtros HEPA. La sala
deberá estar certificada periódicamente por una empresa externa.
16. Las zonas
limpia y contaminada contarán con cámaras o unidades refrigeradas
independientes, con temperatura y capacidad adecuadas para la conservación de los
productos en sus distintas etapas de elaboración.
17. Los equipos y
elementos de elaboración, envases, conservación, etcétera, deberán contar con
sistemas de esterilización y regulación de la temperatura indispensable para
mantener los productos en elaboración o elaborados dentro de las
especificaciones declaradas en la solicitud de inscripción del producto.
Al solicitar su
habilitación, los laboratorios elaboradores de vacunas antiaftosa declararán la
capacidad mensual y anual de elaboración de productos terminados de su planta
de producción, calculada en base a los siguientes parámetros:
- La capacidad de
elaboración y conservación de antígeno, de acuerdo al equipamiento disponible,
los procedimientos de producción utilizados y la fórmula cuali-cuantitativa
declarada para la elaboración de vacunas monovalentes y polivalentes.
- La capacidad de
almacenamiento en cámaras frías de productos terminados que deberán guardar
relación con la capacidad de producción total y que permitan cuarentenar las
series en control hasta su liberación o decomiso.
- Cámaras o
unidades refrigeradas para conservación de materia prima y/o en proceso de
elaboración.
Toda modificación
a la capacidad mensual declarada deberá estar precedida de una correspondiente
ampliación de los parámetros especificados.
Los laboratorios
comprendidos en la categoría b. del artículo 2º sólo deberán cumplir con lo
exigido para el área limpia, la formulación y el envase que se estipulan en el
presente Anexo.
ANEXO II
NORMAS DE
SEGURIDAD BIOLOGICA PARA LA MANIPULACION DEL VIRUS
DE LA FIEBRE AFTOSA
I) INTRODUCCION:
El objetivo de
este Anexo es establecer las normas de seguridad biológica mínimas requeridas
para la manipulación del virus de la Fiebre Aftosa que deberán cumplir todos los establecimientos autorizados por el SENASA y que involucrarán, clasificándolos
de mayor a menor riesgo, a las siguientes categorías:
• Instalaciones de
grandes animales inoculados.
• Laboratorios
productores de vacunas.
• Instalaciones de
pequeños animales inoculados.
• Laboratorios de
diagnóstico y control.
• Laboratorios de
investigación.
Todos los
laboratorios que manipulan virus aftoso deben trabajar en condiciones de
contención absoluta. Las medidas de bioseguridad implementadas deben excluir
toda posibilidad de fuga del virus. El nivel de bioseguridad 3 A es el exigido para dichos laboratorios.
Solo se autorizará
el envió de virus activo a laboratorios de Nivel 3 A de bioseguridad habilitados por la autoridad competente.
II) MEDIDAS DE
CONTENCION BIOLOGICA
INDICE
1. ESTRUCTURA
FISICA.
1.1. Accesos
(ingresos – egresos de personal y elementos).
1.1.1 Vestuarios
1.1.2 Air-lock
1.1.3 SAS o
esclusa
1.1.4 Autoclave de
frontera
1.2. Elementos
constructivos
1.2.1
Terminaciones
1.2.1.1 Paredes
1.2.1.2 Pisos
1.2.1.3 Techos y
cielorrasos
1.2.2 Puertas
1.2.3 Ventanas
1.2.4
Instalaciones de servicio
1.2.4.1
Electricidad
1.2.4.2 Agua y gas
1.2.5 Tratamiento
de efluentes
1.2.6 Tratamiento
del aire
1.3.
Comunicaciones
1.4 Advertencias
1.5 Mantenimiento
y control
2. CONDUCTA Y
PROCEDIMIENTOS
2.1 Personal
2.1.1 Supervisor
de seguridad biológica
2.1.2 Capacitación
2.1.3 Control de
acceso
2.1.4 Visitantes y
personal de mantenimiento
2.1.5 Cuarentena
obligatoria
2.1.6 Emergencias
2.2 Actividades en
el laboratorio
2.2.1 Manipulación
de material de riesgo
2.2.2 Animales
inoculados
2.2.3 Egresos de
materiales y equipos
2.2.4 Medidas de
higiene
2.2.5 Tratamiento
de residuos
2.2.6 Cabinas de
Seguridad Biológica
II.1. ESTRUCTURA
FISICA:
Los requerimientos
fundamentales para asegurar la BIOCONTENCION están basados en las barreras
arquitectónicas funcionales que aseguren la HERMETICIDAD de todo el edificio, teniendo en cuenta los aspectos que se detallan a
continuación, considerando que cuanto menor sea la superficie utilizada mayor
será la posibilidad de controlarla y también, menor el personal involucrado.
Los laboratorios
deberán:
a) Definir los
ambientes donde se trabajará con virus infeccioso, concentrándolas en el mínimo
de superficie posible.
b) El área
contaminada deberá contar obligatoriamente con vestuarios limpio y sucio
(dobles) con baños y duchas destinados exclusivamente al ingreso y egreso del
personal de la zona de manejo de virus aftoso activo.
c) El ingreso y
egreso del personal deberá efectuarse y controlarse con un sistema de clave o
tarjeta individual.
d) Las puertas de
las duchas interna y externa deberán estar intertrabadas eléctricamente, el
sistema asegurará que cada persona que egrese del área contaminada tome una ducha
de TRES (3) minutos como mínimo.
e) El edificio
debe contar con ventanas con doble vidrio sellado y con SEIS (6) milímetros de
espesor como mínimo, puertas señalizadas, suelos, paredes, mesadas y techos de
fácil limpieza, no porosos y lavables, resistentes a ácidos, álcalis y al calor
moderado.
f) La construcción
deberá ser de mampostería robusta y de características tales que aseguren la
hermeticidad y solidez de la edificación a través del tiempo.
g) La salida del
material de la zona contaminada deberá realizarse a través de autoclave de
frontera o con cabina de fumigación por formol (Air Lock o SAS) o cabina de
paso con lluvia química (Pass trough) según el caso, las puertas de estos
equipos deberán estar intertrabadas y ser herméticas. Estos equipos contarán
con sistemas de registro.
h) Las carcazas de
pequeños animales contaminados y otros efluentes sólidos como los filtros
deberán ser autoclavados y luego incinerados.
i) Se efectuarán
procedimientos de limpieza y descontaminación química primaria.
j) Se colocarán
carteles con instrucciones y procedimientos de bioseguridad y para emergencias
como: incendios, rotura de envases conteniendo material infeccioso, etcétera.
k) Se contará con
salida de emergencia señalizada, con alarma y registro de apertura.
1.1. Accesos
(Ingresos - Egresos de personal y elementos)
1.1.1 Vestuarios:
Constarán de una
zona considerada limpia donde se dejarán todas las pertenencias; un pasaje de
entrada con sistema mecánico de paso en una sola dirección y que impida el
retroceso; un vestuario contaminado donde el personal calzará y vestirá
indumentaria adecuada. A la salida, en el vestuario contaminado se dejará toda
la ropa y calzado utilizado dentro de la zona restringida, habrá un lugar para
lavarse las manos y uñas, mucosa de fauces y nariz. La ducha será obligatoria y
tendrá enclavadas las puertas de manera tal que al cerrar la de entrada se
conecte el agua durante TRES (3) minutos, y luego recién podrá abrirse la
puerta de salida. Toda esta zona deberá ser cómoda y agradable creando buena
sensación en el personal.
1.1.2 Air-lock,
SAS o Cámara de Fumigación con formol:
Consiste en un
local con condiciones de estanqueidad total, con DOS (2) puertas herméticas
intertrabadas, con alarma sonora y lumínica contra apertura simultánea,
utilizado para introducir o retirar materiales o equipos de gran volumen que
por sus características no permitan ser autoclavados a efectos de su
descontaminación mediante vaporización con formol y neutralización con
carbonato de amonio. Deberá contar con sistema de eliminación de gases y sus
puertas herméticas y burleteadas deberán estar intertrabadas con un
temporizador programable para apertura. Deberá contar con controles y
registros.
1.1.3 Esclusa
(Pass through):
Son pequeñas
cámaras de fumigación química con ácido cítrico al CERO COMA DOS POR CIENTO
(0,2 %), con doble puerta para introducir o sacar materiales o elementos
pequeños que por su naturaleza o contenido no permiten el autoclavado o
recipientes con sustancias herméticamente cerradas a efectos de una
esterilización externa del envase. Deberá contar con sistemas de control y
registro.
1.1.4 Autoclave de
Frontera:
Utilizada en la
descontaminación y esterilización de materiales descartables, material de
vidrio, residuos y eventualmente para la introducción de elementos para uso
interno. Tendrán doble puerta hermética intertrabada y utilizarán calor húmedo
(vapor) a CIENTO QUINCE GRADOS CENTIGRADOS (115° C) como mínimo, distribuyendo
el calor uniformemente. Debe asegurarse la esterilización del material tratado,
con control y registro de tiempo, presión y temperatura.
1.2. ELEMENTOS
CONSTRUCTIVOS
1.2.1.
Terminaciones:
1.2.1.1 Paredes:
Las paredes
perimetrales de la zona contaminada deberán ser monolíticas que garanticen
hermeticidad, con revoques resistentes y pinturas o revestimientos que no sean
afectadas por productos químicos ni presentes irregularidades que entorpezcan
la limpieza.
1.2.1.2 Pisos:
No deberán tener
cámara de aire bajo el solado, el cual a su vez deberá ser resistente a
productos químicos y de fácil limpieza. Deberán tener un coeficiente de dureza
alto para evitar prontos desgastes y deterioros.
1.2.1.3 Techos y
Cielorrasos:
Deberán ser
monolíticos y su sellado con los muros lindantes deberá ser perfecto, para
mantener una hermeticidad total. Si presentasen empotramiento de luminarias sus
uniones deberán ser selladas con caucho siliconado.
1.2.2. Puertas:
Deberán tener un
grado de cierre que permita el mantenimiento de las cascadas de presión de
aire, las interiores, con sectores vidriados para visualizar del otro lado
(excepto baños), de ser posible con condiciones de cierre automático. Cuando se
exijan específicamente herméticas, deberán contar con doble contacto en sus
CUATRO (4) costados con burletes preferentemente inflables, con estanqueidad al
aire y al agua.
1.2.3. Ventanas:
De tamaño reducido
cumpliendo con el mínimo requerido de superficie para iluminación natural, con
paños fijos, continuos a la pared y doble vidrio, resistentes para eventuales
roturas y para soportar la despresurización ambiental. Deberán presentar
condiciones de hermeticidad total.
1.2.4.
Instalaciones de Servicios
1.2.4.1
Electricidad:
Los tableros
seccionales dentro de la zona contaminada deben ser estancos y sellados, con
cargas bien repartidas y con información y esquema de circuitos para su
identificación. Todas las cañerías exteriores que atraviesen un muro divisorio
entre zonas, deberá ser sellado con caucho siliconado en ambos parámetros del
mismo.
Se dispondrá de un
grupo electrógeno que cubra las necesidades eléctricas de la zona contaminada,
con tablero de transferencia automática, que asegure el mantenimiento
permanente de la presión negativa. Se recomienda que los motoventiladores del
sistema de tratamiento de aire y las cabinas de seguridad biológica estén
conectados también a un Sistema de Alimentación Ininterrumpida (SAI / UPS).
1.2.4.2 Agua, gas
y vapor:
Las cañerías al
penetrar en la zona contaminada deberán estar selladas con caucho siliconado
para conservar la hermeticidad. Deberán presentar, una vez entradas, un codo
sifón o válvula antiretorno que impida el retroceso de aire con escape virósico
en caso de un corte de suministro y si quedase vacía la cañería.
1.2.5. Tratamiento
de efluentes:
a) La zona
dedicada a este tratamiento será considerada contaminada por lo tanto deberá
ser exclusiva y totalmente hermética, con un sistema que asegure la
inactivación total del virus aftoso.
b) Las cañerías y
los accesorios deberán garantizar su estanqueidad y soportar la presión
negativa de las salas sin que se produzcan desifonajes.
c) El sistema
completo de tratamiento de los efluentes, incluido el transporte hasta la
unidad de tratamiento, debe cumplir con los requisitos de elevada contención
debiendo ser las cañerías que transportan el efluente de acero inoxidable.
d) La capacidad de
almacenamiento (depósitos) debe ser suficiente para los efluentes no tratados.
Se recomienda contar con DOS (2) tanques de tratamiento.
e) Los tanques de
recepción y tratamiento deberán estar instalados dentro del área restringida y
dentro de piletas de contención.
f) Los equipos
deben disponer de sistemas de controles automáticos para asegurar su debido
funcionamiento. Se debe comprobar y registrar que se ha alcanzado la temperatura
o el pH y el tiempo necesarios y que la instalación se detendrá automáticamente
al alcanzarse los límites requeridos.
g) El proceso de
tratamiento se podrá efectivizar por DOS (2) medios con exposición de todo el
volumen del efluente durante el tiempo requerido:
Químico: hidróxido
de sodio o carbonato de sodio u otro tratamiento alcalino con pH 12,0 durante
por lo menos DIEZ (10) horas. Los materiales deben mezclarse perfectamente y
después del tratamiento las muestras deben ser neutralizadas y el pH verificado
antes de liberar el efluente. Se debe contar con control, registro y regulación
automática y continua del pH.
Térmico: CIEN
GRADOS CENTIGRADOS (100° C) mínimo, durante UNA (1) hora, con control y
registro automático y continuo de la temperatura y tiempo.
1.2.6. Tratamiento
del aire:
El sistema de
ventilación del área contaminada debe ser exclusivo para dicha zona.
a) El aire deberá
ser extraído de la zona de manipulación del virus a través de un sistema de
prefiltros y doble filtración HEPA con NOVENTA Y NUEVE COMA NOVENTA Y SIETE POR
CIENTO (99,97 %) de eficiencia mínima, incluidos en la zona contaminada.
b) Se deberá
garantizar una cascada de presión negativa según el riesgo de cada sala. La
presión negativa será de al menos TRES COMA CINCO (3,5) milímetros de agua
–TREINTA Y CINCO (35) Pascales- en las salas de laboratorios y de al menos
CINCO (5) milímetros de agua – CINCUENTA (50) Pascales- en las salas de
producción de virus a gran escala, salas de grandes y pequeños animales y
tratamiento de efluentes líquidos. Se deberán instalar manómetros para medir la
presión negativa en cada una de las salas, conectados a un sistema de
telemetría que permita el registro.
c) Los filtros
HEPA se deben poder instalar, probar y cambiar dentro de la zona contaminada.
Se requerirá una certificación anual de su integridad.
d) Se deber contar
con un sistema de filtros HEPA en paralelo que mantenga el sistema operativo
durante las maniobras de instalación y cambio de filtros. El reemplazo de los
prefiltros y filtros absolutos deben seguir un procedimiento debidamente
protocolizado.
e) Se debe contar
con motoventilador de extracción alternativo con entrada automática.
f) Se deben
instalar manómetros para medir la presión negativa y la caída de presión a
través de los filtros. Los manómetros deben ser controlados y regulados
periódicamente y deberán tener alarmas incorporadas. Un sistema de registro
informático de las presiones de aire que permita trazabilidad, deberá estar
disponible.
g) El aire de
inyección deberá ingresar en todos los casos a través de prefiltros. En los
locales de grandes animales y laboratorios productores de vacunas a través de
prefiltros y filtros HEPA.
h) El aire
extraído deberá pasar por DOS (2) etapas de filtros HEPA con eficiencia mínima
del NOVENTA Y NUEVE COMA NOVENTA Y SIETE POR CIENTO (99,97 %) para partículas
de CERO PUNTO TRES (0.3) micrones con sistema en paralelo y alternancia
automatizada, quedando siempre uno en "stand by".
i) Los ductos del
sistema serán herméticos y a su paso por zonas limpias tendrán juntas bridadas
y abulonadas.
j) Todo el sistema
deberá ser monitoreado y controlado con manómetros de presión diferencial.
k) La eficiencia
de los filtros deberá verificarse por ensayo con aerosoles monodispersos en
tamaño de CERO PUNTO TRES (0.3) micrones D.O.P (Dioctilftalato) o sistema
validado equivalente, siendo conveniente que la instalación presente las
boquillas de inyección y lectura fijas en él, para realizarse con los filtros
instalados.
l) El cambio de
filtros deberá realizarse desde la zona contaminada, previa fumigación con
formaldehído de los mismos, se retirarán embolsados para su autoclavado dentro
de la zona contaminada y posteriormente incinerados.
1.3.
COMUNICACIONES:
Será
imprescindible contar dentro de la zona restricta con medios de comunicación
con el exterior que faciliten las tareas del personal involucrado. Deberá
contarse con una línea telefónica con fax, intercomunicadores y/o una
computadora personal conectada a la red exterior, como mínimo.
1.4. ADVERTENCIAS:
Deberán colocarse
carteles indicadores de cada zona con el logo de bioseguridad. Además en
lugares estratégicos y bien visibles otros, alertando sobre riesgos biológicos
y los procedimientos a seguir.
1.5. MANTENIMIENTO
Y CONTROL:
El buen
funcionamiento del área de contención dependerá en gran medida del acertado
mantenimiento de su estructura física, instalaciones y equipos y del correcto
cumplimiento de las medidas de bioseguridad dispuestas, todo ello a cargo de
personal idóneo especializado.
Se deberá
implementar un plan de mantenimiento y control preventivo que incluya todos los
sistemas de bioseguridad, con personal propio o externo.
Se deberán
realizar y registrar pruebas de hermeticidad, de corte de energía y de cambio
al sistema de extracción de aire alternativo al menos semestralmente.
2. CONDUCTA Y
PROCEDIMIENTOS:
2.1. Supervisor de
seguridad biológica: Será el profesional de nivel superior responsable de las
condiciones de seguridad biológica.
2.1.2.
Capacitación: El equipo técnico deberá tener entrenamiento específico en
Virología de Fiebre Aftosa y recibir formación permanente en seguridad
biológica; dicho entrenamiento deberá estar documentado y registrado
debidamente.
2.1.3. Control de
acceso: Sólo podrá ingresar el personal autorizado. Las entradas y salidas de
las zonas restrictas deben realizarse solamente a través de los vestuarios, con
cambio de ropa a la entrada y salida y ducha obligatoria a la salida. Dichas
entradas y salidas deben ser registradas diariamente.
Los lugares de
acceso restringido contarán con carteles de advertencia, símbolo de riesgo
biológico, agente que se manipula, nombre y teléfono del supervisor de
seguridad biológica.
La ropa usada por
el personal en la zona contaminada será de distinto color al del área limpia.
El cambio total de la ropa a la entrada de la zona contaminada y la ducha, con
tiempo mínimo de TRES (3) minutos a la salida, es obligatorio para todo el
personal que entre a dicha zona. La ropa deberá ser lavada dentro del área
contaminada caso contrario deberá ser autoclavada antes de su egreso.
2.1.4. Visitantes
y personal de mantenimiento: Deben conocer los procedimientos de las normas de
bioseguridad y cumplir con ciertos requisitos: cuarentenas, descontaminación de
materiales y equipos. Además deberá registrar su firma en un Registro de
Visitantes con datos de hora de entrada y salida del laboratorio, dirección y
teléfono.
2.1.5. Cuarentena
obligatoria: El personal estable, visitantes y personal de mantenimiento deberá
comprometerse a no tener contacto con animales susceptibles y a no residir en
áreas en donde habiten estos animales, así como mantener un periodo de
cuarentena obligatoria de TRES (3) días luego de ingresar al laboratorio y
antes de entrar en contacto con animales susceptibles. En el caso de trabajar
con grandes animales infectados el plazo se extenderá a SIETE (7) días.
Se deberá
completar un acta de compromiso de cuarentena.
2.1.6.
Emergencias: El personal debe estar debidamente capacitado y cumplir con los
procedimientos operativos establecidos para un correcto accionar ante derrames,
accidentes, emergencias médicas, fuego y exposición a agentes químicos e
infecciosos. Deberá contar con elementos y equipos de protección ante riesgos
biológicos, químicos y físicos.
2.2 ACTIVIDADES EN
EL LABORATORIO:
2.2.1.
Manipulación de material de riesgo: Todo el proceso de manipulación de grandes
masas virales debe efectuarse dentro de sistemas cerrados. Cada vez que se
trabaje fuera de vasos cerrados deberá realizarse en cabinas de seguridad
biológica Clase II.
El acceso a las
semillas de virus estará restringido únicamente al personal autorizado. Se
llevará un registro de las semillas existentes; éstas deberán estar debidamente
identificadas y contabilizadas.
2.2.2. Animales
inoculados: deben ser considerados dentro de un tratamiento especial los
animalarios en donde se trabaja con presión negativa mínima de MENOS CINCUENTA
(-50) PASCALES y la ropa del personal afectado deberá quedar en dicha área para
su descontaminación. Luego de finalizadas las experiencias, los animales
grandes serán sacrificados y sometidos a proceso de digestión. Los animales de
laboratorio serán autoclavados y luego incinerados.
2.2.3. Egreso de
materiales y equipos: todo material y/o equipo debe pasar por un proceso de
descontaminación antes de salir del área restricta, dicho proceso dependerá de
la naturaleza del material y su tamaño. Los métodos utilizados pueden ser:
• Físicos:
• Calor húmedo
(autoclave) a CIENTO QUINCE GRADOS CENTIGRADOS (115° C) por TREINTA (30)
minutos
• Calor seco
(estufa) a CINCUENTA GRADOS CENTIGRADOS (50° C) por CUARENTA Y OCHO (48) horas.
• Químicos:
• Desinfectantes
aldehídos: Formaldehído (gas) para la fumigación de cabinas de seguridad,
air-locks, esclusas, etc. y formalina (líquido) en una dilución de UNO EN DIEZ
(1:10) para desinfección de superficie.
• Hipocloritos: en
concentraciones de QUINIENTOS (500) y MIL (1.000) partes por millón de cloro
disponible.
• Alcalis:
carbonato de sodio al CUATRO POR CIENTO (4 %), hidróxido de sodio.
• Acidos: ácido
cítrico al CERO COMA DOS POR CIENTO (0,2 %), ácido acético al UNO POR CIENTO (1
%).
2.2.4. Medidas de
higiene: dentro del área restricta las superficies de trabajo, los pisos,
etcétera deben ser descontaminadas con el desinfectante apropiado por lo menos
UNA (1) vez al día. Esta tarea será realizada por personal especialmente
preparado para trabajar en esta área.
El lavado de la
ropa debe efectuarse con agua caliente previa descontaminación, preferentemente
dentro de la zona sucia.
2.2.5. Tratamiento
de residuos: los residuos sean líquidos o sólidos (reciclables o no) deberán
recibir en todos los casos tratamientos por calor, químico o incineración antes
de su egreso.
Tratamiento de
residuos sólidos:
a) Los residuos
sólidos serán tratados por calor húmedo en autoclave de frontera, con puertas
intertrabadas y condiciones de hermeticidad aún en estado de reposo. Deberán
programarse diferentes ciclos validados según el tipo de material que aseguren
su correcta esterilización.
b) La autoclave
deberá contar con sistema de registro.
c) En caso de
averías los sistemas deben estar protegidos contra las posibles descargas de
material infeccioso al exterior.
2.2.6. Cabinas de
Seguridad Biológica.
La manipulación de
virus aftoso en el laboratorio fuera de vasos cerrados se realizará en cabinas
de seguridad biológica de Clase II certificadas anualmente por empresas
autorizadas para tal fin.
ANEXO
III
INSPECCION, RETIRO
Y CODIFICACION DE MUESTRAS
INSPECCION Y
RETIRO DE MUESTRAS
La presentación
para los retiros de series deberá hacerse de acuerdo a las fechas estipuladas
en el calendario anual de Control de Vacuna Antiaftosa.
Una vez presentada
la solicitud de retiro de muestra en la Mesa de Entradas de Muestras por parte
del laboratorio elaborador se inicia el control de la serie de vacuna de
acuerdo al Manual de Procedimientos de la DILAB.
En el laboratorio
elaborador, sobre las dosis presentadas, se realiza un sorteo al azar basándose
en la numeración de las estampillas de los frascos, tomándose como retiro
mínimo lo siguiente:
A) Presentación de
UN (1) sólo tamaño de envase:
- Frascos de más
de CINCUENTA (50) dosis – VEINTICUATRO (24) unidades.
- Frascos menores
a CINCUENTA (50) dosis – TREINTA Y SEIS (36) unidades.
B) Presentación de
varios tamaños de envase:
- Frascos de CIEN
(100) o más dosis – VEINTE (20) unidades.
- Frascos de
CINCUENTA (50) a CIEN (100) dosis - VEINTE (20) unidades.
-Frascos menores a
CINCUENTA (50) dosis - VEINTE (20) unidades.
En la cámara
refrigerada del laboratorio elaborador se realiza el conteo total de dosis
presentadas.
Una vez separados
los frascos estampillados de acuerdo al sorteo se procede a distribuirlos en
CUATRO (4) paquetes que luego se lacran y se firman, quedando DOS (2) paquetes
como contramuestra en el laboratorio elaborador.
Se completa el
acta de retiro de muestras con la cantidad de dosis, el número de estampillas
de los frascos seleccionados por sorteo, firmando los responsables por
laboratorio productor y por SENASA.
Si hubiera
devolución de estampillas se adjunta al trámite.
Las actas se
realizan por duplicado quedando una copia en el laboratorio elaborador.
Las muestras deben
trasladarse refrigeradas entre los CUATRO (4° C) y QUINCE (15° C) GRADOS
CENTIGRADOS.
Las muestras
(Paquetes Nros. 1 y 2) y el trámite interno con su respectiva acta de retiro
deberán ser entregados a la Mesa de Entrada de Muestras; ésta otorgará un Nº de
Orden de Análisis y será su personal el responsable de abrir el Paquete Nº 1,
verificar la temperatura y distribuir la muestra a las Coordinaciones de
Bacteriología y de Fiebre Aftosa. El restante del Paquete Nº 1 y el Paquete Nº
2 lacrado serán entregados a la Coordinación de Fiebre Aftosa a fin de ser
conservados entre los CUATRO (4° C) y OCHO (8° C) GRADOS CENTIGRADOS.
El Paquete Nº 2 se
mantiene como contramuestra hasta su vencimiento. En el caso de la
determinación de la masa antigénica se remiten las muestras para ser analizadas
en el Centro de Virología Animal (CEVAN) del CONSEJO NACIONAL DE
INVESTIGACIONES CIENTIFICAS Y TECNICAS (CONICET).
CODIFICACION DE
VACUNAS PARA LA PRUEBA DE EFICACIA
Las vacunas en
prueba perderán su identidad mediante una codificación, en la cual se utilizan
frascos metálicos numerados, donde se introduce el frasco original de vacuna y
se precinta la tapa. Al momento de la codificación se confeccionan las
siguientes planillas:
Planilla 1: En la
cual consta el Nombre del Laboratorio elaborador, Nombre del producto, Nº de
serie y Nº de estampilla del frasco a utilizar.
Esta planilla es
firmada por los representantes de la Cámara Argentina de la Industria de Productos Veterinarios (CAPROVE) y del SENASA presentes
en la codificación de la prueba y permanece en un sobre cerrado, lacrado y
firmado, hasta su finalización.
Planilla 2: En la
que figura la fecha de Vacunación, el Nº de frasco con su Nº de precinto, Nº de
caravana y color de caravanas.
Una vez realizada
la vacunación en el Campo Experimental el personal del SENASA y de a CAPROVE
firman la planilla Nº 2.
En el libro de
actas del Campo Experimental se asientan todas las tareas realizadas y las
novedades si las hubiera, firmando la mencionada acta todos los intervinientes.
Esto debe realizarse en cada prueba de vacunación y sangrado.
A los SESENTA (60)
días se sangran los animales vacunados, realizándoles el Control Indirecto por
Elisa FL (PI), una vez obtenidos los resultados, se informan en la Orden de análisis correspondiente.
Se eleva a Mesa de
Entradas General la solicitud de retiro y las órdenes de análisis en la cual
constan los resultados, confeccionando dicha área el Certificado
correspondiente del Producto Biológico, firmado por el Director o el
Coordinador General del Laboratorio Animal.
Una vez finalizado
todo el proceso se archiva la solicitud de retiro de muestra y las órdenes de
análisis con los resultados en Mesa de Entradas - Archivo.
DECODIFICACION
Una vez
finalizados la totalidad de los controles se procederá a la apertura de los
sobres y recipientes oportunamente lacrados o precintados a los efectos de
identificar las marcas y series de las vacunas en control y confeccionar un
acta.
A) CONTROLES
FISICO-QUIMICOS
1. Control de tipo
de emulsión (para emulsión simple)
Prueba de la Gota: Con una pipeta de UN (1) mililitro se deposita una gota de la vacuna en un envase con
agua destilada. La gota deberá permanecer compacta o formará una película
siempre en la superficie.
2. Control de
Estabilidad de la Emulsión
a) Por centrifugación
de CUARENTA (40) mililitro de vacuna durante UNA (1) hora, a DOS MIL (2.000)
REVOLUCIONES POR MINUTO separándose la fase aceitosa no emulsionada en la parte
superior, y la emulsión sin romper en la parte inferior. Se permitirá una
pequeña separación de líquido oleoso en la superficie siendo todo el resto una
emulsión uniforme.
b) Manteniendo la
vacuna a diferentes temperaturas: Temperatura ambiente y a TREINTA Y SIETE
GRADOS CENTIGRADOS (37° C) durante TREINTA (30) días. Sólo será permitida una separación
inferior de fase acuosa de hasta un CINCO POR CIENTO (5 %) del volumen total.
3. Control de
Conductividad: Se medirá con celda de conductividad del tipo de inmersión cuya
constante sea no menos de SETENTA Y CINCO CENTESIMOS (0,75) micro Siemens/centímetros.
La medición se realizará a VEINTE (20° C) –MAS MENOS DOS (+-2)- GRADOS
CENTIGRADOS.
La exactitud del
equipo para realizar la determinación debe ser no menor al UNO POR CIENTO (1
%).
El valor máximo
aceptable será de CINCO (5) micro Siemens/centímetros.
4. Control de
viscosidad: Se realizará utilizando un viscosímetro de Brookfield con rotor y
expresada en centipoise. Se utilizará el rotor Nº 2 y la determinación se
efectuará a una velocidad de TREINTA (30) revoluciones por minuto.
Se aceptarán como
valores mínimos y máximos QUINCE (15) y QUINIENTOS (500) centipoise
respectivamente, medidos a temperatura ambiente.
B) CONTROL
BACTERIOLOGICO.
1- Para cultivo de
Anaerobios facultativos y Aerobios.
Se sembrará un
mililitro de vacuna en medio Tioglicolato fluido USP con el agregado de Tween
80 al UNO POR CIENTO (1 %) en tubos con DIEZ (10) mililitros de medio.
2- Para hongos
saprofitos y patógenos.
Se sembrará CERO
COMA CINCO (0,5) mililitros de vacuna en Agar glucosa CUATRO POR CIENTO (4 %)
según Sabouraud en tubos con CINCO (5) mililitros de medio.
3- Para
determinación de contenido microbiano.
Se sembrará CERO
COMA CINCO (0,5) mililitros de vacuna en Agar caso- Peptona de Caseína –
Peptona de harina de soja USP en tubos con CINCO (5) mililitros de medio.
Se siembran DOS
(2) juegos de tubos con los TRES (3) medios de cultivo y se incuban a
VEINTICINCO (25° C) y a TREINTA Y CINCO (35° C) GRADOS CENTIGRADOS durante
CATORCE (14) días.
INTERPRETACION: La
muestra debe ser estéril para pasar a las siguientes etapas de control. Se
considera el control aprobado cuando no se observa desarrollo bacteriano o
fúngico en los cultivos efectuados.
C) CONTROL DE
INOCUIDAD:
Las pruebas de
inocuidad oficiales se realizarán exclusivamente sobre muestras de antígenos o
vacunas que tengan controles de inocuidad previos con resultados satisfactorios
realizados por el elaborador.
Cada elaborador
deberá presentar el método de ruptura de emulsión para su producto.
Test de Inocuidad
en Células
Ruptura de la
emulsión para vacunas oleosas emulsión simple: Se procede a homogeneizar la
vacuna colocando CIEN (100) mililitros en una probeta de QUINIENTOS (500)
mililitros. Se agregan CIEN (100) mililitros de cloroformo, mezclar y trasvasar
el volumen total a tubos para ser centrifugado a DOS MIL (2.000) revoluciones
por minuto durante VEINTE (20) minutos y a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C).
Posteriormente se
observa la separación de las fases:
- Una capa
inferior oleosa que se descarta.
- Una capa
superior "sobrenadante" que es lo que se recupera.
- Preparación e
Inoculación de células:
1. La línea
celular utilizada es BHK 21 CLON 13, debe observarse su morfología al
microscopio y verificar que la monocapa esté completa. También pueden emplearse
células IBRS 2.
2. Se procede a
inocular con el sobrenadante UN (1) mililitro por cada frasco Roux o frasco de
CIENTO SETENTA Y CINCO (175) centímetros cuadrados. El volumen de sobrenadante
restante se separa en DOS (2) tubos; uno de ellos es analizado por Test de
Elisa a fin de comprobar la presencia de los antígenos que componen la vacuna
quedando el otro como contramuestra.
3. Incubar las
botellas inoculadas a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C) durante
CUARENTA Y OCHO (48) horas.
4. Congelar a
MENOS VEINTE GRADOS CENTIGRADOS (-20° C) y descongelar.
5. Realizar un
nuevo pasaje celular empleando DIEZ (10) mililitros del pasaje anterior. Se
realizan TRES (3) pasajes en células en total, registrando cada pasaje en la
planilla de Control de Productos Biológicos - Inocuidad donde constan los datos
de cada serie.
6. Observar si se
presenta efecto citopático.
7. Someter a
Fijación de Complemento o ELISA tipificación.
Interpretación de
los resultados: La serie de vacuna en control será liberada a la siguiente
etapa de control cuando no se observe efecto citopático en los cultivos
celulares ni sea detectado virus por Fijación de Complemento o ELISA en el
sobrenadante del último pasaje.
Ruptura de
emulsión para vacunas oleosas con hidróxido de aluminio.
Elución de
Antígenos.
Buffer de elución
1.2 Molar:
PO4HK2
|
158,85 gs
|
PO4KH2
|
39,19 gs
|
H20 destilada
c.s.p. 1.000 ml
|
|
PH 7,4
|
|
Esterilizar en
autoclave:
|
PBS 0,01M
|
pH 7,4
|
Solución A:
|
KH2PO4
|
68,04 gs/litro
|
Solución B:
|
K2HPO4
|
87,09 gs/litro
|
Tomar TRES PUNTO
TREINTA Y SEIS (3.36) mililitros de la solución A y DIECISEIS (16) mililitros
de la solución B y llevar a MIL (1.000) mililitros con cantidad suficiente de
agua bidestilada, autoclavar QUINCE (15) minutos a UNA (1) atmósfera.
Bicarbonato SIETE
PUNTO CINCO POR CIENTO (7.5 %)
CO3HNa 7.5gs
H20 destilada
c.s.p. 100,00ml
Método A
1) Tomar
DOSCIENTOS (200) mililitros de vacuna y agregarle VEINTE (20) mililitros de
Cloroformo -DIEZ POR CIENTO (10 %)-.
2) Se centrifuga a
MIL QUINIENTAS (1.500) revoluciones por minuto durante CINCO a DIEZ (5 a 10) minutos en centrífuga refrigerada a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C).
3) Se desecha el
sobrenadante y el sedimento se le agregan CIEN (100) mililitros de SOLUCION
SALINA FOSFATO 0,01 Molar, se agita y se vuelve a centrifugar a MIL QUINIENTAS
(1.500) revoluciones por minuto durante CINCO (5) minutos.
4) Se vuelve a
desechar el sobrenadante y al sedimento se le colocan CUARENTA (40) mililitros
de Buffer de elusión 1,2 UNIDAD MOLAR. Agitar la mezcla con agitador magnético
durante CUARENTA Y CINCO (45) minutos a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C).
5) Centrifugar MIL
QUINIENTOS a DOS MIL (1.500 – 2.000) revoluciones por minuto durante QUINCE
MINUTOS (15) minutos a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C).
6) Extraer el sobrenadante
y conservar. Al sedimento restante agregarle CUARENTA (40) mililitros de Buffer
de elusión y proceder de la misma forma que en el punto 4.
7) Se unen los
sobrenadantes de las primera y segunda eluciones completando un total de
aproximadamente OCHENTA (80) mililitros de antígeno eluido.
8) Llevar el
volumen del eluido al doble del volumen inicial con agua destilada estéril y
agregarle OCHO POR CIENTO (8 %) de POLITIMEL ETIL GLICOL 6.000.
9) Agitar CUARENTA
Y CINCO (45) minutos a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C) con agitador magnético.
10) Dejar reposar
por un período mínimo de TRES (3) horas o toda la noche a CUATRO GRADOS
CENTIGRADOS (4° C).
11) Centrifugar a
NUEVE MIL (9.000) rpm durante DIEZ (10) minutos.
12) Desechar el
sobrenadante y diluir el pellet en CUATRO (4) mililitros de Medio Eagle de
mantenimiento. Se separan en fracciones para:
a) Comprobación de
presencia antigénica por ELISA.
b) Contramuestra
en inocuidad hasta finalización del control.
c) Siembra en
cultivos celulares. Roux o frascos de CIENTO SETENTA Y CINCO CENTIMETROS
CUADRADOS (175cm2), TRES (3) pasajes con incubación a TREINTA Y SIETE GRADOS
CENTIGRADOS (37° C) durante CUARENTA Y OCHO (48) horas cada uno.
Observar si se
presenta efecto citopático y realizar fijación de complemento o ELISA en el
sobrenadante del último pasaje.
Método B
1) Tomar
DOSCIENTOS (200) mililitros de vacuna y agregarle DIEZ (10) mililitros de
Alcohol Bencílico – CINCO POR CIENTO (5 %)-
2) Se centrifuga a
MIL QUINIENTAS (1.500) revoluciones por minuto (rpm) durante CINCO a DIEZ (5 a 10) minutos -centrífuga refrigerada a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C)-.
3) Se obtienen
TRES (3) fases. Se continúa trabajando con la interfase según lo establecido en
el punto 12-c del método A.
Observación: En
las vacunas oleosas con hidróxido de aluminio después de la ruptura de la
emulsión, se procederá a la elusión del antígeno.
INTERPRETACION
Toda serie de
vacuna será liberada a la siguiente etapa de control cuando no se observe
efecto citopático en los cultivos ni sea detectado virus por Fijación de
Complemento o ELISA.
Test de Inocuidad
en ratones
Los animales
utilizados son ratones lactantes F1 o Balb C de CUATRO (4) a SEIS (6) días de
vida. Se colocan SEIS (6) crías con su madre en cajas con cama seca y limpia,
alimento balanceado y agua para bebida.
Es recomendable un
período de adaptación de VEINTICUATRO (24) horas en la sala dónde serán
inoculados y posteriormente revisados a fin de evitar muertes por falta de
cuidado materno.
Se usan CUATRO (4)
cajas por cada serie de vacuna, que son rotuladas indicando:
• Serie de Vacuna
• Laboratorio
• Fecha
• Número de caja.
Inoculación de los
animales:
Se transporta la
vacuna refrigerada hasta el lugar de inoculación, se toman las jeringas
estériles de UN (1) mililitro y previa homogeneización de la vacuna se carga la
jeringa y se inocula CERO COMA UN (0,1) mililitro en cada ratón lactante por
vía subcutánea en su dorso. Las madres no son inoculadas.
Los ratones son
observados durante UNA (1) semana, llevándose un registro de su estado en una
planilla.
Interpretación de
los resultados:
En caso de
ausencia de sintomatología y/o muertes, la prueba se considera negativa.
En caso de haber
sintomatología específica de Fiebre Aftosa (parálisis) o muerte se debe
procesar la muestra (disecar – morterear - añadir Cloroformo -congelar y
descongelar) y luego realizar la Fijación de complemento o ELISA de
Tipificación. Si hubiera resultado positivo la vacuna será rechazada.
ANEXO V
CAMPO EXPERIMENTAL
En el campo
experimental se realiza el Control de Eficacia de las Vacunas Antiaftosa con
bovinos libres de anticuerpos específicos de la Fiebre Aftosa, provenientes de zonas libres y sin vacunación.
Ubicación:
Vivero Forestal
"Las Salicáceas" - Localidad: 25 de Mayo (Provincia de LA PAMPA). Superficie aproximada del predio: CIENTO SESENTA Y DOS MIL QUINIENTOS METROS
CUADRADOS (162.500 m2).
Instalaciones e
infraestructura:
OCHO (8) corrales
con capacidad total para MIL (1.000) bovinos, manga, embarcadero, balanza,
laboratorio para fraccionamiento de sueros, vivienda para el personal del
SENASA y puesto de vigilancia.
Vigilancia y
mantenimiento del predio:
Vigilancia:
Es realizada por
una empresa acreditada en seguridad, que realiza vigilancia durante las
VEINTICUATRO (24) horas y registra ingreso y egreso de personas y vehículos en
un cuaderno numerado de la empresa. No está permitido el ingreso de personas
sin autorización expresa de la DILAB.
Mantenimiento:
A cargo del
personal del SENASA.
Recepción de
animales vírgenes:
El paratécnico
deberá controlar la integridad y numeración del precinto del camión, el Número
de caravana de sangría y el estado de los animales en el momento de la
recepción, cotejando dichos datos con la planilla que remite el veterinario
actuante del SENASA en el momento del embarque, que deberá acompañar a los
animales.
Deberá volcar en
el "Acta de Recepción de Bovinos" por duplicado, la fecha, la
cantidad de bovinos, sus datos personales, los datos del transportista y en las
observaciones asentar la conformidad o no conformidad de lo recibido. Deberán
firmar ambos el original y el duplicado del acta. El original del "Acta de
Recepción de Bovinos" se archiva en la carpeta con el mismo nombre y el
duplicado se entrega al transportista.
Asimismo, los
animales recibidos serán registrados en la "Planilla de Existencia de
Bovinos" en el sector de animales ingresados vírgenes en el que consta la
fecha, remanente, ingresos y total de animales. Archivar en la carpeta del
mismo nombre.
Ingreso de
forrajes:
El paratécnico
deberá controlar la calidad y cantidad del fardo de heno de alfalfa. Se
registra en la "Planilla de Existencia de Heno de Alfalfa"
completando los datos solicitados en el sector de ingreso de heno de alfalfa.
Alimentación:
Se suministra la
ración de CERO COMA SETENTA Y CINCO (0,75) fardo de heno de alfalfa de VEINTE A
VEINTICINCO (20 a 25) kilogramos por animal distribuido en DOS (2) raciones
diarias, el CINCUENTA POR CIENTO (50 %) por la mañana y el CINCUENTA POR CIENTO
(50 %) restante por la tarde, los SIETE (7) días de la semana.
Se registra en la
"Planilla de Existencia de Heno de Alfalfa" la cantidad de fardos por
corral y por día, el total y el stock. Se archivará en la carpeta del mismo
nombre.
Animales vacunados:
Una vez realizada
la vacunación oficial el paratécnico deberá registrar en la "Planilla de
Existencia de Bovinos" sector de animales vacunados y egresados, el Número
de Prueba y la cantidad de animales utilizados, restándolo del stock de animales
vírgenes.
Egreso de
animales:
Finalizadas las
pruebas de control de Vacunas Antiaftosa por Elisa, los animales podrán ser
liberados luego de transcurridos SIETE (7) días de la revacunación, que deberá
ser realizada por un profesional y se deberá controlar el Número de la Caravana de vacunación con la planilla de la prueba correspondiente, confeccionándose el Acta
de Egreso de Bovinos. Luego asentará su salida en la "Planilla de
Existencia de Bovinos" sector Animales vacunados y egresados.
Control sanitario
de los animales:
El paratécnico
deberá observar diariamente el estado general y sanitario de los bovinos y el
correcto suministro de agua. De encontrar algún animal cuyo estado no sea
óptimo deberá apartarlo, llevarlo al Lazareto y comunicar cualquier novedad
inmediatamente a la DILAB.
ANEXO VI
ADQUISICION,
VACUNACION Y SANGRIA DE BOVINOS:
Los laboratorios
que presenten vacunas a control deberán hacerse cargo de la compra de los
animales, de su traslado y alimento.
Características de
los animales:
Bovinos: raza
Polled Hereford / Hereford -Hasta CINCO POR CIENTO (5 %) de astados
descornados-.
Edad: DIECIOCHO
(18) a TRINTA Y SEIS (36) meses
Peso: Entre
DOSCIENTOS CUARENTA (240) y CUATROCIENTOS (400) kilogramos más menos (+/-) DIEZ
POR CIENTO (10 %).
Sexo: Macho
castrado
Animales
provenientes de zonas libres de Fiebre Aftosa sin vacunación.
Campos de
procedencia:
Deben estar
ubicados en la zona libre de Fiebre Aftosa sin vacunación.
Debe tener
instalaciones acordes para el manejo de los animales (Potreros, mangas con
cepo, corrales, balanza individual, etcétera).
Debe tener vías de
acceso confiables, que garanticen un movimiento programable de los animales.
Estado sanitario
general:
Personal del
SENASA supervisará el control del estado sanitario de los animales verificando
que sean lotes homogéneos (peso, raza y edad), buen estado sanitario y de
nutrición, libres de ecto y endoparásitos.
Se realizará una
sangría previa de los animales a adquirir identificados con igual número de
caravana oficial en oreja derecha y marcación a fuego, y se remitirán los
sueros a la DILAB a fin de realizar las técnicas correspondientes. Serán
aceptados los animales para ser incorporados a la prueba de control en cuyo
suero sanguíneo no se detecten anticuerpos específicos de la Fiebre Aftosa, detectable por Elisa Estructural y Elisa 3 ABC.
Los animales
recibirán tratamiento específico contra endo y ectoparásitos antes de su
traslado al campo experimental. Los animales permanecerán en cuarentena en el
campo de procedencia, VEINTE (20) días como mínimo.
El embarque de los
animales al campo experimental de vacunación será supervisado por personal del
SENASA y se realizará en camiones precintados.
El Campo de
vacunación debe garantizar un adecuado cuidado de los animales de prueba (alambrado
perimetral que permita un seguro aislamiento de los campos vecinos,
alimentación con heno de alfalfa de zonas libres de Fiebre Aftosa), agua
potable en cantidad suficiente; debe permitir un manejo acorde con las tareas a
realizar, contando con manga con cepo, corrales de aislamiento, potreros,
galpones para stock de raciones, casilla de vacunación e iluminación; a su vez,
debe tener vías de acceso transitables en toda época del año.
La ropa de trabajo
será de uso exclusivo para el personal que desarrolla tareas en el
establecimiento.
VACUNACION Y
SANGRIA DE LOS ANIMALES:
Los animales
tendrán un plazo de adaptación después del ingreso al campo de vacunación de
CATORCE (14) días como mínimo.
Vacunación y
Primera Sangría:
Se vacunarán y
sangrarán utilizando tubos con vacío y tapón perforable -CERO (0) días
postvacunación- DIECISIETE (17) animales por cada serie de vacuna en control y
se incluirán DOS (2) testigos por prueba. En las series de vacunas que se
presenten a registro se vacunarán DOS (2) lotes de DIECISIETE (17) animales y
se incluirán DOS (2) testigos. Los animales serán debidamente identificados y
reunirán las condiciones establecidas previamente.
Antes de la
vacunación se realizará la palpación del área de inoculación en la tabla del
cuello, a fin de verificar la ausencia de nódulos pre-existentes. De
presentarse, se deberá anotar en la columna de observaciones de la planilla de
vacunación.
En el momento de
la vacunación se coloca la caravana de vacunación con logo del SENASA numerada,
en la oreja izquierda del animal, dicho número consta en una Planilla, que
permite identificar fehacientemente al animal vacunado. También se registra en
dicha Planilla el número de la caravana de sangría.
- Tipo de jeringa:
de vidrio calibrada, que asegure la exactitud de la dosis.
- Tipo de aguja:
común para aplicación subcutánea e intramuscular.
- Responsables de
la aplicación: profesionales de DILAB.
- Vía y lugar de
aplicación: según indicación del laboratorio productor, respetando las
prácticas de rigor y evitando el reflujo de vacuna.
- Conservación de
la vacuna: De acuerdo a las indicaciones del laboratorio productor.
- Manejo del
animal: Los animales deben manejarse durante el proceso de encierre y
vacunación evitando factores estresantes.
- Sangrías: Se
realizará la segunda sangría a los TREINTA (30) días post-vacunación; los
sueros obtenidos se fraccionarán en CUATRO (4) juegos de tubos eppendorfs
rotulados con el Número de Prueba, Número de Suero, Número de Frasco y DPV.
Cada juego de
sueros será guardado en paquetes identificados con los datos de Número de
Prueba, Número de Frasco y DPV, lacrados y firmados por los profesionales
actuantes de la DILAB y de CAPROVE. A los SESENTA (60) DPV se realizará la
tercera sangría y se procederá de la forma antes explicada.
A los NOVENTA (90)
DPV, si a la vacuna se le realiza el desafío viral, se procederá a la cuarta
sangría, fraccionando los sueros de igual forma que en las sangrías anteriores.
Los paquetes con los sueros serán conservados en la DILAB a MENOS VEINTE GRADOS CENTIGRADOS (– 20° C) hasta el vencimiento de la serie de vacuna,
a excepción del 4º paquete, el que una vez terminadas las pruebas de control
será entregado al Laboratorio Elaborador.
ANEXO VII
DESAFIO VIRAL
El costo del
alquiler de los boxes de desafío, el transporte y el alimento correrán por
cuenta de los laboratorios elaboradores.
Transporte:
Los camiones jaula
que efectúen el transporte de los bovinos en prueba desde el campo de
vacunación hasta los galpones de descarga deberán estar precintados y
acompañados por custodia del SENASA.
Galpones de
aislamiento:
Deberá ajustarse
en un todo a lo establecido en el Anexo II – Bioseguridad, de la presente
resolución.
Los animales de
cada prueba deben estar agrupados por serie de vacuna. Deberán mantener un
compartimiento para los animales testigos.
Deberá tener
condiciones ambientales adecuadas para estabular los animales de prueba.
Deberá contar con
instalaciones acordes para el manejo de los animales.
Arribo de animales:
Descanso después
de la llegada al galpón y previo a la descarga: mínimo VEINTICUATRO (24) horas
y máximo de SETENTA Y DOS (72) horas.
El galpón donde se
alojen los animales permanecerá cerrado durante el desarrollo de la prueba bajo
responsabilidad del personal del SENASA.
Virus de descarga:
El virus de
desafío deberá tener los controles previos de caracterización, tipo y subtipo
por Fijación de Complemento o por ELISA Tipificación caracterización por
anticuerpos monoclonales y secuenciación.
Titulación del
virus:
Se realiza en
ratón lactante.
Se utilizan como
mínimo SEIS (6) ratones por dilución de virus.
Se realizan
diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 de la suspensión virulenta en medio Eagle.
Se inoculan para
cada dilución DOS (2) cajas de ratones lactantes conteniendo cada una SEIS (6)
ratones de CUATRO (4) a SEIS (6) días de edad; la inoculación es
intraperitoneal y se inoculan CERO PUNTO UN (0.1) mililitros por ratón. La
prueba se lee diariamente durante SIETE (7) días y los ratones muertos se morterean
y el material obtenido se procesa por Fijación de Complemento al CINCUENTA POR
CIENTO (50 %). El título se expresa en dosis letales CINCUENTA POR CIENTO (50
%) en ratón lactante por mililitro (DL50 RL/ml) y se calcula a partir de los
resultados del SEPTIMO (7º) día de lectura según el método de Spearman –
Kärber.
Adicionalmente la DILAB podrá realizar la titulación en bovinos.
Desafío de los
bovinos:
A los NOVENTA (90)
DPV cada grupo de DIECISEIS (16) animales serán inoculados por vía
intradermolingual con UN (1) mililitro de una dilución de la cepa oficial de
virus de descarga que contenga DIEZ MIL (10.000) dosis infectante ratón
lactante/mililitro o DIEZ MIL (10.000) dosis infectante bovino/mililitro.
En cada descarga
se utilizan DOS (2) bovinos vírgenes en calidad de testigos.
Los animales serán
observados a los SIETE (7) días post-inoculación. Para que la prueba sea válida
se deberá verificar que los animales testigos presenten lesiones podales debido
a la generalización viral.
Se consideran protegidos
los bovinos vacunados que no presenten lesiones podales en ninguno de sus
miembros.
Metodología de la
inoculación:
- Tipo de jeringa:
de UN (1) mililitro – calibrada, descartable.
- Tipo de aguja:
Medida para inoculación intradérmica 15/5 milímetros.
- Lugar de
aplicación: Intradermolingual.
- Modo de
aplicación: CUATRO (4) puntos; volumen de inyección por punto CERO PUNTO
VEINTICINCO (0.25) mililitros.
- Sangrado de los
animales vacunados y testigos previo a la descarga.
Manejo de los animales:
Garantizar la
provisión de agua ad libitum y alimento suficiente.
Lectura:
- Sujeción
correcta del animal.
- Retirar material
podal de bovinos testigos y vacunados para su posterior tipificación.
- Finalizada la
prueba la totalidad de los animales son sacrificados y los cadáveres sometidos
a proceso de digestión.
ANEXO VIII
CONTROL DE
TOLERANCIA
1. MATERIAS PRIMAS
Los laboratorios
productores de vacunas antiaftosa deberán adjuntar a cada presentación de serie
a control oficial:
1.1. Protocolo de
control de calidad de origen con especificaciones físico-químicas y biológicas
de las materias primas utilizadas en la elaboración de la vacuna.
1.2. Protocolos de
control de calidad interno en los aspectos físico-químicos, biológicos y test
de toxicidad de las materias primas utilizadas en la elaboración de las
vacunas, con carácter de Declaración Jurada, bajo la responsabilidad del
Director Técnico del laboratorio productor.
1.3. Si la DILAB lo solicitara, los laboratorios productores deberán entregar muestras de todos los
componentes que integran la vacuna terminada, en el momento que los inspectores
del SENASA lo requieran. La toma de muestras se hará constar en el Acta de
Inspección respectiva. Las muestras permanecerán en la DILAB para los fines que el SENASA disponga. La DILAB realizará los controles de toxicidad u
otro toda vez que lo considere necesario.
2. PRUEBA DE
TOLERANCIA CLINICA
2.1. Los bovinos
utilizados en la prueba de eficacia serán observados mientras dure la prueba,
para valorar la tolerancia post-vacunal del inmunógeno.
2.1.1. La
aparición de reacciones indeseables atribuibles a la vacuna será motivo de
valoración, según los siguientes criterios:
a) Muerte de UNO
(1) o más animales;
b) Torción o
rigidez de cuello, síntomas nerviosos o trastornos en la locomoción, shock
anafiláctico y toda otra reacción indeseable en UNO (1) o más animales;
c) Aparición de
nódulos visibles en el punto de inoculación de un diámetro superior a los DIEZ
(10) centímetros en TRES (3) o más animales. En este caso, los animales de la
serie en control se remitirán para la prueba de tolerancia en frigorífico.
En caso de
presentarse las reacciones indeseables descritas en el punto 2.1.1. a) y b), se
realizará una prueba de tolerancia ampliada a la serie en control.
3. PRUEBA DE
TOLERANCIA EN FRIGORIFICO
3.1. Se evaluará
la presencia de nódulos post-vacunales en la totalidad de los bovinos usados en
la prueba de eficacia. Los parámetros de evaluación serán el peso del nódulo
disecado post-sacrificio. Las series serán valoradas por el método estadístico
de T de Student utilizando un parámetro estimador normal máximo de CINCUENTA
(50) gramos. La DILAB queda facultada a utilizar otro método que en el futuro
demuestre similar utilidad, valorada estadísticamente. Todas las series
rechazadas por esta prueba tendrán opción, a pedido del elaborador, de ser
sometidas a la Prueba de Recontrol de Tolerancia en Frigorífico.
3.2. Recontrol de
tolerancia en Frigorífico: Será realizado en un Campo Oficial del SENASA y
supervisado en toda la ejecución de la prueba por personal oficial, en un
número no menor a CINCUENTA (50) bovinos que serán provistos por el laboratorio
elaborador. Se evaluará la aparición de reacciones generales o de nódulos
post-vacunales según los criterios establecidos en 2.1 y 3.1 del presente
Anexo. La valoración de nódulos en frigoríficos será realizada entre los
SESENTA (60) y NOVENTA (90) días post-vacunación. Será rechazada y decomisada
toda serie de vacuna que no superara este recontrol.
4. PRUEBA DE
TOLERANCIA AMPLIADA
4.1 Será realizada
en un Campo Oficial del SENASA y supervisada en toda la ejecución de la prueba
por personal oficial, en un número no menor a CIEN (100) bovinos que serán
provistos por el laboratorio elaborador. Se evaluará la aparición de reacciones
generales o de nódulos post-vacunales según los criterios establecidos en los
puntos 2.1 y 3.1 del presente Anexo.
4.2 En caso de
muertes o reacciones indeseables atribuibles a la vacuna la serie en control
será rechazada.
ANEXO IX
PRUEBAS INDIRECTAS
1. Por cada serie
en control se vacunarán como mínimo DIECISIETE (17) bovinos libres de
anticuerpos que reúnan las condiciones establecidas en el Anexo V de la
presente resolución. Los animales serán sangrados a los CERO (0), TREINTA (30)
y SESENTA (60) días post-vacunación.
2. Los animales
serán sangrados a los SESENTA (60) DPV MAS MENOS CINCO (+/- 5) días, para ser
valorados por la técnica de Elisa en fase líquida cuyo protocolo de trabajo se
detalla en el presente Anexo.
3. Todos los
sueros de las sangrías serán fraccionados en el campo experimental del SENASA
en CUATRO (4) alícuotas y serán envueltas, lacradas y firmadas. Una de ellas
queda en poder de la DILAB para su procesamiento, DOS (2) permanecerán en
dependencias de la DILAB como contramuestras, hasta TREINTA (30) días después
de la terminación de la prueba. Una muestra permanecerá lacrada en la DILAB y será entregada a los representantes de CAPROVE una vez concluidos la totalidad de los
controles, si son solicitados.
4. La DILAB será la única responsable de las pruebas para valoración de eficacia de vacuna
antiaftosa.
5. En los casos en
que se produjeran problemas técnicos en la realización de los controles
indirectos que impidieran arribar a conclusiones precisas, la DILAB decidirá al respecto.
6. Metodología
estándar de trabajo:
Elisa en fase
líquida para determinación del nivel de anticuerpos en animales vacunados
contra la Fiebre Aftosa.
1. Reactivos y
Materiales.
1.1 Antígenos: Se
utilizarán las cepas oficiales de control O1 Campos, A24 Cruzeiro, A Argentina
2001 y C3 Indaial, con DOS (2) pasajes en células BHK-21, inactivados,
titulados y conservados a MENOS VEINTE GRADOS CENTIGRADOS (-20° C) con glicerol
al CINCUENTA POR CIENTO (50 %).
1.2 Sueros de
captura: de cobayo o conejo hiperinmunizados con las cepas oficiales de control
purificadas (140 S), en su título de uso.
1.3 Sueros
detectores: mezcla de CUATRO (4) anticuerpos monoclonales para cada cepa de
control, en su título de uso.
1.4 Conjugado
anti-ratón, en su título de uso.
1.5 Sustrato:
solución de ABTS con CERO COMA CERO CINCO POR CIENTO (0,05 %) de Agua Oxigenada
TREINTA (30) volúmenes.
1.6 Solución de
Fluoruro de Sodio.
1.7 Sueros
problema: de los bovinos vacunados con las series en control, sangrados a los
CERO (0), TREINTA (30) y SESENTA (60) días post-vacunación.
1.8 Sueros
control: sueros bovinos con títulos dentro del rango de UNO PUNTO CINCO (1.5),
UNO PUNTO OCHO (1.8) y DOS PUNTO UNO (2.1).
1.9 Diluyentes:
PBS + 0,05 % Tween 20 + 3% Albúmina bovina. Tampón carbonato – Bicarbonato pH
9,6. Solución de lavado: PBS + 0,05 % Tween 20 (PBST).
1.10 Placas para
Elisa de NOVENTA Y SEIS (96) pocillos (Nunc-Maxisorp, Greiner o similares).
1.11 Placas
auxiliares de NOVENTA Y SEIS (96) pocillos (tipo Hemoaglutinación fondo en u).
1.12 Lector para
lectura espectrofotométrica de placas de Elisa con filtro de CUATROCIENTOS
QUINCE (415) milímetros.
1.13 Interfase
para conectar el lector a un computador.
1.14 Computador y
programa para cálculos de títulos en prueba Elisa.
2. Esquema de la Técnica.
Elisa fase líquida
monoclonal - Prueba de Eficacia - Dilución Final
Para la
cuantificación de anticuerpos contra el virus de la Fiebre Aftosa en suero, kit de CEVAN.
DILUCION FINAL:
CUATRO (4) DILUCIONES
PRINCIPIO
Las muestras de
suero a titular son diluidas UNO EN DIECISEIS (1:16), UNO EN SESENTA Y CUATRO
(1:64), UNO EN DOSCIENTOS CINCUENTA Y SEIS (1:256) y UNO EN MIL VEINTICUATRO
(1:1024) e incubadas con una cantidad constante de antígeno en placas de
incubación.
En placas de ELISA
se adsorbe el suero de captura: antisuero de conejo contra la Fiebre Aftosa, específico de tipo viral.
La mezcla
suero-virus es transferida a la placa de ELISA para medir la cantidad de
antígeno libre.
Como reactivo
detector se utilizan anticuerpos monoclonales específicos de tipo. Se agrega
conjugado HRP-anti-ratón- IgG y el sustrato (ABTS-H2O2).
La reacción es
detenida y leída en un lector automático de Elisa.
Cada placa es
validada usando SEIS (6) sueros controles.
Los datos pueden
ser procesados con un programa de cálculo en una computadora (PC).
PROCEDIMIENTO
Pasos Preliminares
Llevar los
reactivos a temperatura ambiente antes de usarlos.
Antes de comenzar
el test, marcar la posición de las muestras problema y controles en la hoja Protocolo"
de acuerdo a la siguiente distribución (ver Esquema de Placa):
DIECISIETE (17)
muestras de suero: diluciones UNO EN DIECISEIS (1:16) a UNO EN MIL VEINTICUATRO
(1:1024) -final UNO EN TREINTA Y DOS (1:32) a UNO EN DOS MIL CUARENTA Y OCHO
1:2048)-.
SEIS (6) Sueros
Controles: diluciones UNO EN DIECISEIS (1:16), UNO EN TREINTA Y DOS 1:32) y UNO
EN SESENTA Y CUATRO (1:64) -final UNO EN TREINTA Y DOS (1:32) a UNO EN CIENTO
VEINTIOCHO (1:128)-.
OCHO (8) Controles
de Virus -OD = CIENTO POR CIENTO (100 %) - DOS (2) Blancos.
Nota: en el caso
de tener los DOS (2) testigos de la Prueba de Eficacia, ubicarlos en el lugar
correspondiente a controles CIENTO POR CIENTO (100 %) en H9 y H10, en dilución
UNO EN OCHO 1:8) -final UNO EN DIECISEIS (1:16)-.
PRIMER DIA
1) Sensibilizar la Placa de ELISA.
Rotular la Placa de ELISA con el tipo de virus a testear.
Preparar la
dilución de uso de captura: SESENTA (60) ul de captura CIEN (100x) en SEIS (6)
mililitros de buffer carbonato/bicarbonato.
Agregar CINCUENTA
(50) ul de suero de captura específico (en dilución de uso) en todos los
pocillos.
Mover la placa
suavemente para permitir que el líquido se distribuya homogéneamente.
Cubrir la placa de
ELISA con un film adhesivo.
Incubar una noche
a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C).
2) Dilución de las
muestras: UNO EN DIECISEIS (1:16) - UNO EN SESENTA Y CUATRO (1:64) - UNO EN
DOSCIENTOS CINCUENTA Y SEIS (1:256) y UNO EN MIL VEINTICUATRO (1:1024) – final
UNO EN TREINTA Y DOS (1:32) - UNO EN CIENTO VEINTIOCHO (1:128) - UNO EN
QUINIENTOS DIECISEIS (1:516) y UNO EN DOS MIL CUARENTA Y OCHO (1:2048).
Las diluciones
pueden hacerse directamente en las placas de incubación siguiendo el
procedimiento indicado a continuación:
Usar DOS (2)
placas de incubación.
Agregar CINCUENTA
(50) ul de buffer dilución en las columnas UNO (1) a DIEZ (10).
Agregar CINCUENTA
(50) ul de cada suero a testear en cada pocillo de las columnas 1 (A a H).
Cambiar los tips
para cada muestra.
Hacer diluciones
en base DOS (2) de cada suero desde UNO EN DOS (1:2) hasta UNO EN MIL
VEINTICUATRO (1:1024), usando pipeta multicanal.
Mezclar y
transferir CINCUENTA (50) ul, descartar los últimos CINCUENTA (50) ul.
3) Dilución de los
sueros controles: UNO EN OCHO (1:8) - UNO EN DIECISEIS (1:16) - UNO EN TREINTA
Y DOS (1:32) y UNO EN SESENTA Y CUATRO (1:64) - final UNO EN TREINTA Y DOS
(1:32) UNO EN SESENTA Y CUATRO (1:64) - UNO EN CIENTO VEINTICOCHO (1:128).
Las diluciones
pueden hacerse directamente en las placas de incubación.
a) Hacer dilución
UNO EN OCHO (1:8) de cada control de la siguiente forma:
Agregar SETENTA
(70) ul de buffer dilución en la columna 1 y CINCUENTA (50) ul en las columnas
2, 3 y 4.
Dispensar DIEZ
(10) ul de cada uno de los sueros controles en la columna 1.
Cambiar los tips
para cada suero control.
b) Hacer
diluciones en base 2 de cada control desde UNO EN DIECISEIS (1:16) hasta UNO EN
SESENTA Y CUATRO (1:64) usando pipeta multicanal, de la siguiente forma:
Mezclar y
transferir CINCUENTA (50) ul de la dilución UNO EN OCHO (1:8) ubicada en la
columna 1 de la placa de dilución de controles al pocillo de dilución UNO EN
DIECISEIS (1:16), mezclar y pasar CINCUENTA (50) ul al pocillo de dilución UNO
EN TREINTA Y DOS (1:32) mezclar y transferir CINCUENTA (50) ul al pocillo UNO
EN SESENTA Y CUATRO (1:64) y descartar CINCUENTA (50) ul, usar pipeta
multicanal.
4) Control de
antígeno.
Agregar CINCUENTA
(50) ul de solución dilución en la columna 6 de la placa de incubación de los
controles.
5) Preparación del
antígeno.
Preparar la
solución de antígeno en dilución de uso en buffer dilución inmediatamente antes
de usar. Ver indicaciones del lote a usar.
6) Adición del
antígeno.
Agregar CINCUENTA
(50) ul de la dilución de antígeno en las placas de incubación según el
siguiente esquema.
Placas con sueros
muestra: en columnas 4, 6, 8 y 10.
Placas con sueros
controles: en columnas 2, 3 y 4 (sueros controles) y 6 -control CIENTO POR
CIENTO (100 %)-.
Cubrir las placas
de incubación e incubar una noche a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C).
SEGUNDO DIA
Preparación de la
solución de lavado: PBS 1x - tween CERO PUNTO CERO CINCO POR CIENTO (0.05 %):
PBS 10
x: 100 ml.
Tween:
0.5 ml.
H2O: csp 1 litro.
7) Quitar
cuidadosamente el film de la placa de ELISA.
Lavar todos los
pocillos CINCO (5) veces con DOSCIENTOS (200) ul de solución de lavado.
Golpear firmemente
la placa sobre un papel absorbente para remover el contenido.
8) Transferir
CINCUENTA (50) ul de la mezcla suero-virus desde la placa de incubación a la de
ELISA siguiendo la distribución de muestras y controles indicada en el diagrama
(diagrama de la Placa de ELISA).
Agregar CINCUENTA
(50) ul de buffer dilución en los pocillos H11 y H12 (blanco).
9) Incubar UNA (1)
hora a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C).
10) Lavar CINCO
(5) veces como se describe arriba.
11) Preparar la
dilución de uso del anticuerpo detector: SESENTA (60) ul de detector CIEN (100)
x en SEIS (6) mililitros de buffer dilución.
Agregar CINCUENTA
(50) ul. de detector en dilución de uso en todos los pocillos.
12) Incubar UNA
(1) hora a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C).
13) Lavar CINCO
(5) veces como se describe arriba.
14) Preparar la
dilución de uso del conjugado anti-ratón según titulo del lote:
Preincubar TREINTA
(30) minutos a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C), luego completar a
SEIS (6) milimetros con buffer dilución.
Agregar CINCUENTA
(50) ul de la solución de conjugado en dilución de uso en todos los pocillos de
las placas de los serotipos O1 Campos, A24 Cruzeiro, A Argentina 2001 y C3
Indaial.
Los títulos de los
conjugados pueden presentar variaciones de acuerdo a los lotes que se envía el
proveedor.
15) Incubar UNA
(1) hora a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C).
16) Lavar CINCO
(5) veces como se describe arriba.
17) Preparar
ABTS/H2O2: agregar CERO OCHO (08) ul de H2O2 a SEIS (6) mililitros de ABTS.
Agregar CINCUENTA
(50) ul de ABTS/H2O2 a todos los pocillos.
18) Incubar
TREINTA (30) minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz.
19) Agregar
CINCUENTA (50) ul de solución stop a todos los pocillos.
20) Leer con
filtro CUATROCIENTOS QUINCE (415) en un Lector de ELISA.
21) Sumergir todo
el material usado en una solución de hipoclorito de sodio antes de descartarlo.
VALIDACION DE LOS
RESULTADOS:
Los criterios que
a continuación se describen se aplicarán individualmente a cada placa.
1- Control de
blanco: Cada placa será válida si la densidad óptica (O.D) de los pocillos es
inferior a CERO PUNTO TRESCIENTOS (0.300).
El promedio de las
O.D de los blancos se resta a los OCHENTA Y SEIS (86) pocillos.
2- Control del
CIENTO POR CIENTO (100 %) de las O.D del virus: cada placa será válida si en
SIETE (7) de los OCHO (8) pocillos se obtiene un valor de O.D dentro del rango
específico en cada lote de reactivos.
La O.D resultará del promedio de los valores válidos.
3- Sueros Control:
Para la obtención de los títulos se calculan individualmente sus respectivas
curvas de regresión utilizando las O.D de las diluciones procesadas: UNO PUNTO
CINCUENTA (1.50), UNO PUNTO OCHENTA (1.80) y DOS PUNTO DIEZ (2.10). Se obtiene
para cada suero control el coeficiente de correlación (r) y el título CINCUENTA
POR CIENTO (50 %).
El título para
cada suero será la inversa de la dilución expresada en logaritmo 10, donde se
obtenga el CINCUENTA POR CIENTO (50 %) de O.D. del control del CIENTO POR
CIENTO (100 %) del virus correspondiente.
4- Se aceptan
aquellos sueros control cuyo coeficiente de correlación (r) no sea inferior a
CERO PUNTO NOVENTA (0.90) y cuyos títulos no difieran en más o en menos CERO
PUNTO VEINTE (0.20) log del título histórico.
Una vez aplicado
el factor de corrección se aceptan aquellos sueros cuyos títulos no difieran en
más en menos CERO PUNTO TRECE (0.13) log del título histórico.
La placa quedará aceptada
si al menos CUATRO (4) de los SEIS (6) sueros control cumplen con los criterios
mencionados.
5- Curva Standard:
el título de los sueros controles obtenidos se relaciona con las absorbencias
producidas a una única dilución -UNO EN SESENTA Y CUATRO (1:64 final)- de cada
suero control.
Para ello se
calcula la curva de regresión lineal y el coeficiente de correlación (r).
La Curva Standard
será aceptada si el r es superior a CERO PUNTO NOVENTA (0.90).
El título de cada
suero muestra será expresado como el log DIEZ (10) de la inversa de la dilución
que corresponda al CINCUENTA POR CIENTO (50 %) de densidad óptica del control
del CIENTO POR CIENTO (100 %) de virus.
El título se
redondeará al segundo decimal.
6- Los títulos
obtenidos en cada virus se promedian y ese título final es con DIECISIETE (17)
animales, se realiza una sumatoria de cada suero en los CUATRO (4) virus, y el
animal cuya suma sea la menor es el descartado, con lo cual se vuelven a
promediar los títulos de los DIECISEIS (16) animales restantes, quedando así el
título obtenido como resultado final.
ESQUEMA DE PLACA
--------------
Sueros a analizar - dilución final 1:32 a 1:2048
--------------
Sueros control dilución final 1:32 - 1:64 - 1:128
--------------
Control virus 100%
--------------
Blancos
Controles
indirectos - Dilución acotada.
Cuantificación de
Anticuerpos de Fiebre Aftosa para la aprobación de Vacunas.
DESARROLLO:
– Test de ELISA
para Controles Indirectos para control de Eficacia de Vacunas Antiaftosa.
Preparación del
protocolo de trabajo
En el protocolo de
ELISA se anota el número de la vacuna a controlar y también en cada pocillo se
anota el número de caravana correspondiente a esa vacuna. También se escriben
los sueros controles, el CIENTO POR CIENTO (100 %) de antígeno y el blanco.
Preparación de las
placas auxiliares
Las placas para
cada prueba serán previamente bloqueadas con solución PBST con CINCO POR CIENTO
(5 %) de leche descremada, durante DOS (2) horas a TREINTA Y SIETE GRADOS
CENTIGRADOS (37° C) seguido por un enjuague con agua destilada y posterior
secado.
Por cada placa
auxiliar se pueden testear DIECISEIS (16) sueros. Se coloca arriba de la placa
el número del primer suero y del noveno y así sucesivamente, también se prepara
la placa con los controles y el CIENTO POR CIENTO (100 %) de antígeno.
- Cargar 50 ul de
PBST en:
a) Todos los
pocillos de las columnas de 1 a 4 y 7 a 10 que corresponden a las diluciones
del suero bovino que se quiere analizar.
b) Todos los
pocillos de las columnas 1 a 3 y pocillos G4 y H4 que corresponden a los sueros
controles y a los controles del CIENTO POR CIENTO (100 %) de antígeno.
- Cargar CINCUENTA
(50) ul de solución dilución en:
a) Todos los
pocillos de las columnas 5 y 11 que corresponden a las diluciones de los sueros
bovinos en estudio.
b) Los pocillos de
las filas A hasta F en las columnas 4, 5 y 6 que corresponden a los sueros
controles y a los controles del CIENTO POR CIENTO (100 %) de antígeno.
- Agregar
CINCUENTA (50) ul de cada uno de los sueros a titular en la columna 1 y 7 y
comenzar a hacer las diluciones en base 2 hasta la dilución UNO EN TREINTA Y
DOS (1:32), y en las filas de los sueros controles hasta UNO EN SESENTA Y
CUATRO (1:64) y descartar los últimos CINCUENTA (50) ul.
- Preparar los
virus en sus correspondientes diluciones en solución dilución. Colocar
CINCUENTA (50) ul de virus en los pocillos:
*Las diluciones a
probar de los sueros en estudio.
*Las diluciones de
los controles.
*En los CIENTO POR
CIENTO (100 %) de antígeno.
- Incubar durante
la noche a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C) tapadas con film plástico.
D- PREPARACION DE
LAS PLACAS DE ELISA
Sensibilizar una
placa de ELISA por virus con el suero de captura correspondiente (50 ul por
pocillo) e incubar las placas toda la noche a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C),
envueltas con film plástico asegurándose que el líquido se haya distribuido
uniformemente en el pocillo, agitando suavemente.
E- A las
VEINTICUATRO (24) horas lavar las placas de ELISA sensibilizadas con PBST
CIN-CO (5) veces y secar.
F- Transferir las
muestras suero-virus a la placa de ELISA
Pasar CINCUENTA
(50) ul de la mezcla suero - virus de la dilución UNO EN SESENTA Y CUATRO
(1:64) de los sueros a probar y de las diluciones UNO EN TREINTA Y DOS (1:32) -
UNO EN SESENTA Y CUATRO (1:64) y UNO EN CIENTO VEINTIOCHO (1:128) finales de
los sueros controles de la placa auxiliar a la placa de ELISA sensibilizada.
Transferir los controles del virus - CIENTO POR CIENTO (100 %) - a la placa de
ELISA.
Incubar UNA (1)
hora a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C) sin apilar las placas.
Lavar CINCO (5)
veces con Solución Salina Fosfatada Tween 20 (PBST).
G- Agregar
CINCUENTA (50) ul de anticuerpos monoclonales del título correspondiente a las
placas de ELISA.
Incubar UNA (1)
hora a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C) sin apilar las placas.
Lavar CINCO (5)
veces con PBS.
H- Preparar la
dilución del suero conjugado a la dilución de uso.
Agregar CINCUENTA
(50) ul a todas las placas.
Incubar UNA (1)
hora a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C) sin apilar las placas.
Lavar CINCO (5)
veces con PBST.
I- Cargado de la
solución ABTS en las Placas de ELISA.
Descongelar la
solución de ABTS, agregar en el momento de uso, OCHO (8) ul de agua oxigenada
TREINTA POR CIENTO (30 %) por cada SEIS (6) mililitros de solución.
Colocar
rápidamente CINCUENTA (50) ul en un orden establecido a las placas.
Dejar actuar a
temperatura ambiente durante TREINTA (30) minutos en oscuridad.
J- Frenar la
reacción.
Con CINCUENTA (50)
ul de solución de fluoruro de sodio, siguiendo el mismo orden que en I.
K- Lectura de la
placa
Leer
inmediatamente las placas en el orden que fueron frenadas.
L- Obtención y
validación de los resultados.
Los criterios de
validación que a continuación se describen se aplicarán individualmente a cada
placa.
• 1- Control del
blanco: Cada placa será válida si la O.D promedio de los pocillos es inferior a
CERO PUNTO TRESCIENTOS (0.300). Dicho promedio se resta a la O.D de cada pocillo en toda la placa.
• 2- Control del
CIENTO POR CIENTO (100 %) de O.D del virus: Cada placa será válida si al menos
SIETE (7) de los OCHO (8) pocillos cumplen los siguientes criterios de
aceptación:
Ø Los valores
deberán estar dentro del rango establecido para el kit.
Ø La O.D media de los pocillos aceptados según punto anterior está dentro del rango O.D +/- 0.3.
• 3- Sueros controles:
Para la obtención de los títulos se calculan individualmente sus respectivas
curvas de regresión utilizando las O.D de las diluciones realizadas (1.5-1.8 y
2.1) obteniéndose para cada control el coeficiente r y su título. El título
para cada suero será la inversa de la dilución, expresada en Log y donde se
obtenga el CINCUENTA POR CIENTO (50 %) de O.D del control del CIENTO POR CIENTO
(100 %) del virus correspondiente. Se aceptan aquellos sueros controles cuyo
coeficiente de correlación no sea inferior a CERO PUNTO NOVENTA (0.90) y sus
títulos no difieran en MAS MENOS CERO PUNTO DOS (+/- 0.2) Log del título
histórico para el lote.
Se calcularán las
diferencias entre título obtenido y título esperado para todos los sueros (se
expresan con su signo). Aquéllos que sean <0.06 serán expresados como igual
a CERO (0).
Si al menos CUATRO
(4) de los SEIS (6) sueros presentan diferencias del mismo signo, se aplicará
factor de corrección que se calculará con el siguiente criterio:
3.1- Promediar
todas las diferencias -incluso las diferencias iguales a CERO (0)-que sean
menores a CERO PUNTO DOS (0.2) —considerando su signo—.
3.2- Aplicar
factor de corrección según la siguiente tabla:
DIFERENCIA DEL
TITULO
|
FACTOR DE
CORRECCION
|
0.00<x<0.06
|
No se corrige
|
0.06<x<0.10
|
Corregir por
0.05
|
0.10<x<0.15
|
Corregir por
0.10
|
0.15<x<0.20
|
Corregir por
0.15
|
3.3- Una vez
corregidos se aceptarán aquellos sueros controles cuyos títulos corregidos no
difieran en MAS MENOS CERO PUNTO TRECE (+- de 0.13) del título histórico.
3.4- Recta de
regresión de cada placa:
• Se calculará la
recta de regresión de cada placa con aquellos valores aceptados de los sueros
controles.
• Se aceptarán las
placas que sus curvas de regresión tengan coeficientes de correlación
superiores a CERO PUNTO NOVENTA (0.90).
3.5- Títulos de
los sueros problema: Se obtiene por interpolación del valor de la O.D obtenido en la dilución realizada del suero -UNO PUNTO OCHO (1.8)- en la recta de
regresión correspondiente a su placa.
Los sueros cuyos
títulos sean mayores a DOS PUNTO UNO (2.1) y menores a UNO PUNTO CINCO (1.5) se
expresarán como DOS PUNTO ONCE (2.11) y UNO PUNTO CUARENTA Y NUEVE (1.49)
respectivamente.
3.6- Resultados:
La prueba se hará por duplicado en DOS (2) días diferentes. Para el resultado
se promediarán los títulos obtenidos en ambas determinaciones.
Reactivos: Todos
los reactivos de este kit son proporcionados por el CEVAN.
ANEXO X
ELISA 3ABC
Diagnóstico por
screening de anticuerpos contra proteínas no estructurales del virus de la Fiebre Aftosa. Kit de PANAFTOSA.
Reactivos
suministrados.
1. Solución
PBS-Tween 20x concentrada
2. Suero Equino
3. Solución
Bloqueadora
4. Leche en polvo
descremada
5. Microplacas
sensibilizadas con Proteína 3 ABC
6. Escherichia
coli
7. Suero control
negativo
8. Suero control
padrón 1
9. Suero control
padrón 2
10. Conjugado 100x
concentrado
11. Diluyente del
sustrato
12. Sustrato 100x
concentrada
Test de ELISA 3
ABC
A- Procedimiento
Procedimientos
preliminares:
- Aproximadamente
UNA (1) hora antes de comenzar la reacción, retirar todos los reactivos de la
heladera, con excepción del conjugado, para permitir que se estabilicen a
temperatura ambiente. Límites recomendados de VEINTE (20) a VEINTICINCO GRADOS
CENTI-GRADOS (25° C).
- Preparar la
planilla de la prueba teniendo en cuenta que deben ser reservados DOS (2)
pocillos para el suero control negativo (CN), TRES (3) pocillos para el suero
control padrón 1 (CP1), DOS (2) pocillos para el suero control padrón 2 (CP2) y
UN (1) pocillo para un suero control interno del laboratorio de desempeño
conocido en la prueba.
- Observación: El
análisis de muestras individuales deberá ser realizado contra el suero padrón
CP1 diluido UNO EN VEINTE (1:20).
- Homogeneizar los
reactivos antes de su uso.
- Preparar el
volumen de las soluciones necesarias para la prueba en función del número de
muestras (placas) a procesar siguiendo lo especificado en la Tabla I a seguir.
TABLA I –
Volúmenes y soluciones en función del número de muestras.
Número de
muestras
|
Buffer de lavado
|
Diluyente de
muestra/conjugado
|
1 placa: 88
muestras
|
500 ml.
|
30 ml.
|
2 placas: 176
muestras
|
1000 ml.
|
60 ml.
|
3 placas: 264
muestras
|
1500 ml.
|
90 ml.
|
4 placas: 352
muestras
|
2000 ml.
|
120 ml.
|
5 placas: 440
muestras
|
2500 ml.
|
150 ml.
|
- Buffer de
lavado: Diluir VEINTE (20) veces con agua deionizada y/o destilada la solución
PBSTween 20x. Antes de diluir observe que no haya precipitados; de presentarse,
disolverlos en Baño María a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C). Puede
ser conservada durante DOS (2) semanas a CUATRO GRADOS CENTIGRADOS (4° C).
- Diluyente de
muestras/conjugado: Para preparar CIEN (100) mililitros de esta solución,
disolver INCO (5) gramos de leche descremada en aproximadamente CINCUENTA (50)
mililitros de agua eionizada y/o destilada. Adicionar CINCO (5) mililitros de
solución PBS-Tween 20x concentrada, DIEZ 10) mililitros de suero equino, CIEN
(100) ul de Escherichia coli, homogeneizar y llevar a volumen final on agua
deionizada y/o destilada. Usar en el transcurso del día.
- La dilución del
conjugado y del sustrato debe ser realizada estrictamente CINCO (5) - DIEZ (10)
inutos antes de su uso, de acuerdo a lo especificado en la Tabla II a seguir.
B - Principio del
ensayo
El ensayo consta
de TRES (3) etapas. 1: Incubación de las muestras; 2: Incubación del Conjugado;
: Incubación del Sustrato. Siguen a las DOS (2) primeras etapas ciclos de lavado
y a la última la dición de la solución bloqueadora para detener la reacción.
1- Incubación de
las Muestras: la proteína 3 ABC. Inmovilizada en la microplaca, al entrar en
ontacto con la muestra y en el caso de ésta tener anticuerpos anti-3ABC,
reaccionará con los mismos ormando un complejo antígeno-anticuerpo. Los
anticuerpos que no hayan reaccionado serán eliminados n la etapa de lavado que
sigue a la incubación, quedando solo los anticuerpos 3 ABC adheridos la placa a
través de la proteína 3 ABC.
2- Incubación del
Conjugado: En esta etapa se agrega el conjugado (anticuerpos anti-IgG de ovino
con peroxidasa), que se unirá específicamente al complejo antígeno-anticuerpo
(de haberse omado). De no formarse el complejo en la etapa anterior, el
conjugado no reaccionará y será eliminado urante el lavado que sigue a este
paso.
3- Incubación del
Sustrato: En esta tercera etapa se adiciona el sustrato incoloro TMB/H2O2 obre
el cual actúa la enzima peroxidasa del conjugado. Como resultado de la acción
de la misma se bservará el surgimiento de color azul en aquellos pocillos en
que el antígeno haya retenido anticuerpos anti-3ABC y consecuentemente
conjugado. Por último la reacción es interrumpida al agregarse la solución
bloqueadora, que provoca el viraje del color azul al amarillo.
C- Ejecución del
ensayo.
Incubación de las
Muestras:
- Colocar NOVENTA
Y CINCO (95) ul de diluyente de muestras/conjugado por pocillo en toda la
placa. Adicionar CINCO (5) ul de muestra a analizar o suero control -dilución
final UNO EN VEINTE (1:20)- en el pocillo asignado, siguiendo el orden
establecido en la planilla de prueba. También se pueden prediluir las muestras
problema en una placa auxiliar virgen (sin sensibilizar) colocando CIENTO
NOVENTA (190) ul de diluyente de muestras/conjugado en los pocillos de las
muestras problema, respetando las posiciones definidas en la planilla de prueba
y adicionar DIEZ (10) ul de muestra por pocillo. Homogeneizar las diluciones.
Transferir CIEN (100) ul de las muestras prediluidas a la placa sensibilizada.
Los sueros controles no son prediluidos.
- Sellar la placa
e incubar a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C) MAS MENOS UN GRADO
CENTIGRADO (+/- 1° C), durante TREINTA (30) minutos MAS MENOS TRES (+/- 3)
minutos.
- Antes de
finalizar la etapa de incubación de las muestras prepara el conjugado diluido
según Tabla II.
Lavado:
- Lavar la placa
SEIS (6) veces, en TRES (3) ciclos dobles; concluido el mismo se elimina el
resto de solución golpeando la placa invertida sobre papel secante.
Incubación del
Conjugado:
- Adicionar CIEN
(100) ul de conjugado diluido por pocillo. Sellar la placa e incubar a TREINTA
Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37° C) MAS MENOS UN GRADO CENTIGRADO (+/- 1° C),
durante TREINTA (30) minutos MAS MENOS TRES (+/- 3) minutos.
Antes de finalizar
la etapa de incubación del conjugado preparar el sustrato cromógeno según lo
indicado en la Tabla II.
Lavado:
- Proceder del
modo indicado en la etapa anterior del lavado.
Incubación del
Sustrato-cromógeno:
- Adicionar CIEN
(100) ul de sustrato-cromógeno diluido a cada pocillo, e incubar a temperatura
ambiente durante QUINCE (15) minutos.
- Adicionar CIEN
(100) ul de solución bloqueadora a cada pocillo.
Lectura de la
placa:
- Debe ser
realizada en un plazo máximo de TREINTA (30) minutos después de la adición de
la solución bloqueadora. Leer con filtro de CUATROCIENTOS CINCUENTA (450) nm.
TABLA II:
Preparación del conjugado y sustrato en función del número de placas.
Número de Placas
|
Diluyente
Muestra-conjug.
|
Conjugado 100x
|
Diluyente de
Sustrato
|
Sustrato 100x
|
1
|
11 ml.
|
100 ul.
|
11 ml.
|
110 ul.
|
2
|
22 ml.
|
220 ul.
|
22 ml.
|
220 ul.
|
3
|
32 ml.
|
320 ul.
|
32 ml.
|
320 ul.
|
4
|
42 ml.
|
420 ul.
|
42 ml.
|
420 ul.
|
5
|
52 ml.
|
520 ul.
|
52 ml.
|
520 ul.
|
D- Cálculo de los
resultados
1. Criterio de
aceptación de la prueba.
La prueba será
válida solamente si los sueros controles cumplen los requisitos a seguir.
- Control
negativo: El valor de absorbancia de cada una de las réplicas de este control
debe ser inferior a CERO COMA UNO (0,1). Si cumple calcular la media.
Control Padrón 1
(CP1): El valor de absorbancia de cada una de las réplicas de este control,
luego de sustraer el valor de absorbancia de la media del control negativo
(CN), debe ser superior a CERO COMA QUINCE (0,15). Si sólo una de las réplicas
está fuera de rango, podrá ser desconsiderada, calculando la media con los
otros DOS (2) valores. Si los valores son aceptables, calcular la media y luego
restarle la media del control negativo. Control Padrón 2 (CP2): Sustraer del
valor de absorbancia de cada réplica el valor de la media del control negativo.
Calcular la media. La relación CP2/CP1 deberá ser igual a DOS COMA UNO (2,1)
con una variación máxima de MAS MENOS VEINTICINCO POR CIENTO (+/- 25 %).
De no cumplir con
los requisitos detallados la prueba deberá ser considerada inválida y deberá
ser repetida.
2. Cálculo del
valor de corte (cut-off): Se recomienda como valor de corte (cut-off) para el
análisis de los resultados el valor de la media de la absorbancia obtenida para
el suero Control Padrón 1 (CP1).
3. Análisis de
resultados: Expresar los resultados en relación al suero Control Padrón 1 (CP1)
como:
T/C= (Abs. del
suero en análisis - media Abs. CN) / (media de Abs. de CP1 - media Abs. CN).
La muestra deberá
ser considerada:
- No reactiva para
valores de T/C < 0,8.
- Inconclusiva o
sospechosa para valores de 0,8 < T/C < 1.
- Reactiva para
valores de T/C > 1.
4. Control de
calidad interno: Es aconsejable controlar el desempeño de la ejecución de la
prueba a lo largo del tiempo en las condiciones locales usando un panel
conocido de sueros controles preparados en el propio laboratorio.
EITB
Prueba de western
blot confirmatoria de los resultados positivos y sospechosos por I ELISA 3 ABC.
Kit por PANAFTOSA.
Reactivos suministrados
en el Kit.
- Buffer lavado
10x concentrado.
- Diluyente
Sustrato.
- Tiras
sensibilizadas NC.
- Suero Control
Negativo (CN).
- Suero Control
Padrón 1 (CP1).
- Suero Control
Padrón 2 (CP2).
- Escherichia
coli.
- Leche en polvo
descremada.
- Conjugado 100x
concentrado (anti IgG bovino conjugado con Fosfatasa Alcalina).
- NBT
(Nitro Blue Tetrazolium).
- BCIP
(4) 5-Bromo 4-Chloro 3-Indolyl Phosphate.
Referencia de los
sueros controles:
Control Negativo:
sin anticuerpos contra el virus de la Fiebre Aftosa.
Control Padrón 1:
con bajo título de anticuerpos contra las proteínas 3 ABC, 3D, 2C, 3B, y 3A del VFA. Padrón Validado contra un estándar primario que corresponde al suero de un
animal a SETECIENTOS CATORCE (714) dpi. experimental y del cual no se recuperaba
virus del LEF desde los TRESCIENTOS VEINTICOCHO (328) dpi., la reactividad de
este suero equivale a la máxima reactividad de fondo observada individualmente
para cada uno de los CINCO (5) antígenos en animales no vacunados en regiones
libres de Fiebre Aftosa.
Suero Control
Padrón 2: suero bovino con título medio de anticuerpos contra las proteínas
3ABC, 3D, 2C, 3B y 3A del VFA. Padrón validado contra un standard primario que
corresponde al suero de un animal no vacunado a SETECIENTOS CATORCE (714) dpi. Experimental
y del cual se recuperaba ocasionalmente virus del LEF. La reactividad de este
suero equivale a las mayores reactividades observadas para los CINCO (5)
antígenos en regiones de muy bajo riesgo epidemiológico -TRES (3) años después
del último brote-.
Test
Inmunoenzimática de electrotransferencia en Blot
Ensayo
Saturación de las
tiras:
- Colocar el
número de tiras necesarias para la reacción en las canaletas de las bandejas
usando pinza plástica. Adicionar CERO COMA OCHO (0,8) mililitros de buffer de
saturación en cada canaleta, verificar que las tiras queden bien sumergidas y
con la numeración visible.
- Colocar las
bandejas sobre el agitador y dejar incubando durante TREINTA (30) minutos a
temperatura ambiente. La velocidad del agitador debe ser de SEIS (6)
movimientos oscilatorios/minuto. Esta misma velocidad debe ser mantenida
durante toda la prueba.
Incubación de las
Muestras:
- Adicionar a los
CERO COMA OCHO (0,8) mililitros de buffer de saturación CUATRO (4) ul de la
muestra a analizar o suero control -dilución final UNO EN DOSCIENTOS (1:200)-
de acuerdo al orden establecido en el protocolo de prueba.
- Incubar con
agitación durante SESENTA (60) minutos a temperatura ambiente. Verificar que el
lado numerado de la tira esté visible.
Lavado: Concluida
la etapa de incubación de las muestras, eliminar el buffer de saturación
inclinando la bandeja, evitando trasborde líquido de una canaleta hacia otra.
Invirtiendo la bandeja secarla muy bien sobre papel toalla. Lavar las canaletas
y tiras con abundante buffer de lavado 1x usando una piceta. Secar las bandejas
con papel toalla. Adicionar a continuación UN (1) mililitro de buffer de lavado
1x por canaleta y dejar agitando durante CINCO (5) minutos a temperatura
ambiente. Repetir DOS (2) veces este último procedimiento de lavado. Luego del
último lavado secar muy bien las bandejas golpeándolas invertidas sobre papel
toalla.
Incubación del
Conjugado:
- DOS (2) minutos
antes de finalizar la etapa de lavado diluir el conjugado según lo indicado en la Tabla I y aplicar CERO COMA SEIS (0,6) mililitros por canaleta.
- Incubar con
agitación durante SESENTA (60) minutos a temperatura ambiente.
Lavado: proceder
del modo indicado en etapa anterior.
Incubación del
Sustrato-cromógeno:
- DOS (2) minutos
antes de finalizar la etapa de lavado preparar el sustrato –cromógeno
(NBT/BCIP) según lo indicado en la Tabla I, adicionando primero el NBT al
Buffer sustrato y luego el BCIP.
- Aplicar CERO
COMA CINCO (0,5) mililitros por canaleta e incubar con agitación a temperatura
ambiente hasta que la tira del CP1 desarrolle CINCO (5) bandas visibles,
aproximadamente QUINCE (15) minutos.
Detención de la Prueba:
- Descartar el
sustrato-cromógeno y lavar las tiras con abundante agua. Por último secar bien
las bandejas invirtiéndolas y golpeándolas sobre papel toalla.
- Dejar secar las
tiras y pegarlas en el protocolo de resultados con cinta adhesiva transparente.
Interpretación de
los resultados:
1. Criterios de
validación de la prueba
La prueba será
válida cuando los sueros controles presenten los siguientes resultados:
- Control negativo
(CN): no debe presentar banda de reacción para ninguno de los CINCO (5)
antígenos o estas deben ser apenas apreciables.
- Control Padrón 1
(CP1): debe presentar bandas muy tenues y de intensidad homogénea para cada UNO
(1) de los CINCO (5) antígenos.
- Control Padrón 2
(CP2): debe presentar bandas muy visibles para cada uno de los CINCO (5)
antígenos con intensidades superiores a las del CP1.
Cuando los sueros
controles satisfagan las condiciones detalladas la prueba podrá ser considerada
válida y se podrá proceder al análisis de los resultados. En caso contrario la
prueba deberá ser considerada inválida y deberá ser repetida.
2. Análisis de los
resultados.
La reactividad de
cada suero deberá ser analizada por comparación con la reactividad del suero
control CP1 del mismo gel corrido en la misma prueba, evaluando
comparativamente la intensidad de cada UNA (1) de las CINCO (5) bandas.
La muestra deberá
ser considerada no reactiva si se observa alguna de estas condiciones:
• Ausencia total
de reacción para los CINCO (5) antígenos; o
• reactividad con
intensidad menor a la de la banda correspondiente del CP1 para cada UNO (1) de
los CINCO (5) antígenos, individualmente o en conjunto; o
• reactividad
igual o mayor a la de la banda correspondiente del CP1 para un máximo de DOS
(2) antígenos simultáneamente.
La muestra deberá
ser considerada reactiva si se observa:
• Reactividad para
3 ABC, 3D,3B, 3A, (+/-2C) con intensidad igual o superior a la de la banda
correspondiente al suero control CP1.
El resultado
deberá ser considerado indeterminado:
• Cuando el padrón
de bandas obtenido no se ajuste a los parámetros definidos para muestras
reactivas o no reactivas.
3. Consideraciones
Metodológicas:
Esta prueba
diagnóstica está basada en la detección de anticuerpos. Debe tenerse en cuenta
que la presencia de los mismos no necesariamente indica presencia del virus ya
que puede estar reflejando también infección pasada (memoria inmunológica).
Asimismo, es importante resaltar que existe un intervalo temporal entre la
exposición al virus y la formación de anticuerpos contra el mismo. Pruebas
realizadas con el EITB en animales experimentalmente infectados permitieron
establecer que el proceso de seroconversión puede detectarse a partir de los
SIETE (7) DPI.
TABLA Nº 1
Número de
Muestras
|
Buffer De
Saturación
|
Conjugado 100 x
|
Diluyente de
sustrato
|
NBT
|
BCIP
|
1gel:
25 muestras + 4
sueros controles
|
18,5 ml
|
185 ul
|
15,5 ml
|
110 ul
|
55 ul
|
2 geles
50 muestras + 8
sueros controles
|
36 ml
|
360 ul
|
31 ml
|
220 ul
|
110 ul
|
3 geles
75 muestras +
12 sueros
controles
|
54 ml
|
540 ul
|
45 ml
|
320 ul
|
160 ul
|
ANEXO IV
SENSORES DE FRIO
1. Toda caja de
transporte de vacuna (Unidad de Venta) que contenga frascos de vacunas
antiaftosa y que hayan sido autorizadas para su uso y comercialización deberán
incorporar obligatoriamente para su despacho hacia los lugares habilitados,
según lo establecido en los planes de control y erradicación de Fiebre Aftosa,
un sensor térmico para garantizar que el producto no ha superado los QUINCE
GRADOS CENTIGRADOS (15° C), generando una señal visible e irreversible que no
desaparezca aunque la temperatura posterior a la misma haya descendido.
2. Los sensores
térmicos deberán ser adheridos en la pared interior lateral longitudinal en
contacto con las vacunas y en un lugar que permita una rápida visualización de
su estado, una vez retirados los refrigerantes por parte del receptor.
3. Todos los
despachos deberán consignar el día y la hora en que se incorpora el sensor que
se tomarán como las del inicio del despacho.
4. En ningún caso
el tiempo de traslado de los despachos de vacunas antiaftosa podrán ser
superior a las SETENTA Y DOS (72) horas desde su inicio hasta el momento de la
recepción.
5. Todas las cajas
que transporten vacunas (unidades de venta) deberán incluir adosado en el
exterior de las mismas un instructivo sobre las características de los sensores
y su interpretación.